一株产吲哚乙酸巴基斯坦赖氨酸芽胞杆菌的快速筛选与鉴定

闵 勇，刘晓艳，陈 凌，朱 镭，邱一敏，周荣华

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

自1978 美国奥本大学的J.W.Kloepper 首次提出植物根际促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）的概念以来，PGPR 研究始终是农业微生物学和植物病理学领域的热点。PGPR 可以通过多种机制来促进作物的生长，具体的作用机制主要有以下几个方面：一、直接分泌植物生长激素来促进植物生长；二、分泌有机酸和水解酶类增加植物对营养成分的吸收；三、抑制植物的病害；四、诱导作物系统抗性［1］。在大多数研究中，一种PGPR 通常是通过多种方式协同作用来促进植物的生长。

芽胞杆菌由于其产生芽胞，能够在不同的生境中生存，是研究广泛、深入的PGPR 类群。枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）普遍存在于多种植物的根际土壤中，通过产生伊枯草菌素A（Iturin A）、丰原素（Fengycin）和表面活性素（Surfactin）等脂肽类抗生素来抑制土传真菌性病害，同时还能产生IAA，具有生物固氮能力［2］；某些多粘类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）具有生物固氮能力，还产生吲哚乙酸（IAA）、细胞分裂素等植物激素；同时，多粘类芽胞杆菌还产生杀镰孢菌素（Fusaricidin）、多粘菌素（Polymyxin）等抗生素类物质来抑制植物细菌和真菌性病害［3］。部分巨大芽胞杆菌（Bacillus megateri-um）具有溶磷、解磷能力，能促进作物对磷元素的吸收；部分地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）具有解钾的能力，促进作物对钾元素的吸收利用。PGPR类芽胞杆菌通过协同作用共同促进植物的生长。

长期以来，化肥农药的使用对中国现代农业生产起到了至关重要的作用，但长期不合理的使用对生态环境、粮食安全和人类健康都构成了严重威胁，迫切需要转变生产方式，利用环境友好的生物有机肥产品来部分替代化肥，使用生物农药部分替代化学农药。吲哚乙酸（IAA）作为一种重要的植物激素，能够促进植物的生长，利用IAA 产生菌生产生物有机肥具有重要的生产意义［4］。

本研究对实验室保藏的芽胞杆菌进行产IAA 能力筛选，以期筛选获得产IAA 能力较强的芽胞杆菌菌株，为下一步制备功能生物有机肥奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：湖北省生物农药工程研究中心从土壤中分离并保藏的1 920 株芽孢杆菌。

化学试剂：色氨酸（L-tryptohane，纯度＞99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产），吲哚乙酸标准品（Indole-3-aceticacid，纯度＞99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产）。

Salkowski 显色剂：配置浓度为0.5 mol/L FeCl3溶液，取1 mL FeCl3溶液到50 mL 35% HClO4中摇匀，现配现用，操作时避光。

种子LB 培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 5 g，溶于1 000 mL去离子水中（pH=7.0）；筛选培养基：LB培养基中加入终浓度为3 mmol/L的色氨酸。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌活化 在96孔板中每孔各加入0.5 mL LB 培养基，灭菌后接种芽孢杆菌菌株，将96 孔板放置在粘板上于30 ℃，250 r/min条件下振荡培养48 h。

1.2.2 产IAA 芽孢杆菌的初筛 在灭菌的96 孔板中每孔加入0.5 mL 初筛培养基，吸取10 μL 活化好的芽孢杆菌菌液转移其中，于30 ℃、250 r/min 条件下振荡培养48 h。吸取200 μL 菌悬液于96 孔无菌细胞培养板孔中，于4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，吸取100 μL 上清液于96 孔细胞培养板中，加入等体积Salkowski 显色剂。以初筛培养基作为阴性对照，以20 mg/L IAA 标准液作为阳性对照。将96 孔板置于室温、避光环境下反应30 min，细胞培养板上孔的颜色变红则表示该菌株具有产生IAA的能力。

1.2.3 产IAA 菌株的定量复筛 将初筛中颜色反应明显的菌株进一步定量IAA的产量。标准曲线采用IAA 标准品制作，配置的IAA 标准曲线浓度依次为10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L，分别吸取IAA 标准溶液100 μL，等体积加入Salkowski 显色剂，置于室温、避光环境下反应30 min，取出后立即用酶标仪测定A535nm，以加入了显色剂的培养基调零，重复3次，获得数据制作标准曲线。取1 mL 芽孢杆菌的菌悬液以4 000 r/min 离心10 min，取上清100 μL，等体积加入Salkowski 显色剂，置于室温、避光环境下反应30 min，测定其A535nm，根据标准曲线，计算单位体积发酵液中IAA的含量。

1.2.4 菌株的鉴定

1）形态观察。菌株接种于LB 固体培养基平板上，30 ℃培养48 h，观察菌落形态、色泽，显微镜观察细胞形状等。

2）细菌16S rDNA 序列测定。提取细菌基因组DNA；16S rDNA 基因序列的PCR 扩增，引物为27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R 5′AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；PCR 产物送测序；测序结果在EzBioCloud 网站上进行比对，从网站数据库中获取与菌株16S rDNA 同源的基因序列数据，利用MEGAX 软件做系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 产IAA 芽孢杆菌的初筛

通过96 孔板微培养，对保藏的1 920 株芽孢杆菌进行了活化，通过Salkowski 比色法对1 920 株芽孢杆菌进行了初筛，再通过测量吸光度初步选取12株具有明显产IAA 能力的芽胞杆菌菌株进入后续的定量复筛。

表1 产IAA 芽孢杆菌初筛结果

2.2 IAA 标准曲线的制作

将系列IAA 标准溶液（10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L）与Salkowski 显色剂反应，测得不同IAA 浓度下对应的吸光度A535，如表2。

表2 不同IAA 浓度下样品的吸光度

以IAA 标准溶液浓度为横坐标，纵坐标为对应浓度在535 nm的吸光值，绘制散点图并添加线性趋势线，得到IAA 标准曲线见图1。由图1 可知，线性回归方程y=0.020 1x+0.117 7，R2=0.995 9，拟合优度较好。故可根据此方程计算发酵液中IAA的含量。

图1 IAA 标准曲线

2.3 产IAA 芽孢杆菌的定量复筛

根据标准曲线，对初筛的12 株芽孢杆菌进行了产IAA 能力的复筛，结果见表3。由表3 可知，2750号菌株的产IAA 能力达到（118.23±5.55）mg/L，明显优于其他11 株芽胞杆菌。

表3 产IAA 芽孢杆菌复筛结果

2.4 菌株分子鉴定

将2750 号芽胞杆菌菌株的16S rDNA 基因测序结果在EzBioCloud 网站上进行序列比对，从网站数据库中选取与菌株16S rDNA 同源的基因序列数据，然后用MEGAX 软件进行系统发育分析。结果如图2 所示。由图2 可知，2750 号芽胞杆菌与巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus pakistanensis）位于同一分支，同源性100%。

图2 2750 号芽胞杆菌系统进化树

3 小结与讨论

随着人们生活水平的提高，对农产品质量和生态环境保护的关注度也在持续提高，化肥已不能满足现代农业发展的需要。为实现农业的健康可持续发展，开发新型高效环保肥料势在必行。同时，农业污染已经超过了工业和城市生活污染，成为中国最大的面源污染源。积极探索农业废弃物资源化利用的方式，已成为了中国农业研究的热点。在此背景下，生物有机肥以其独特的优势为农业废弃物和作物生长搭建起一座桥梁，开辟出一条“农业废弃物—生物有机肥—作物”循环模式的可持续发展道路［5］。与化肥相比，生物有机肥具有提高作物产量、改善作物品质、增强作物抗逆性、提高化肥利用率和改善土壤微生态环境的作用。生物有机肥要发挥的这些功能，就要添加具有特定功能的微生物菌种。PGPR类芽胞杆菌具有促进作物生长的功效，是生物有机肥产品开发中重点关注的一类功能菌株。

由于IAA的类似物与Salkowski 显色剂也能产生颜色反应，采用高效液相色谱法测量实际的IAA的产量应该比比色法要低。在产品开发过程中将采用更为准确的高效液相色谱法对该菌株进行深入评价。

本研究未对巴基斯坦赖氨酸芽孢杆菌产IAA 能力进行培养基优化，培养基优化后的菌株产IAA 能力尚未知。在后续的研究中将通过培养基优化进一步提高该菌株的产IAA 能力，同时进行盆栽和田间试验评价其作用。