小鼠H22 肝癌移植瘤模型在PD-1 单抗治疗肝癌中的应用

黄凝 ，祝思宇 ，李鸿泉 ，程曦 ，邓向亮 ，2

1. 广东药科大学中医学院，广东 云浮 527300；2. 广东药科大学附属第二医院，广东 云浮 527300

近年来，基于T 细胞的肿瘤免疫治疗研究取得了重大进展，尤其是在常规疗法无效的晚期肿瘤治疗方面取得重大突破，因此受到广泛关注。PD-1 ／PD-L1 单抗是基于T 细胞的肿瘤免疫疗法的代表性药物［1］。截至 2020 年 6 月，PD-1 ／ PD-L1 单抗已经用于包括肝癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等16 种肿瘤的临床治疗［2］。随着适应证不断扩大，PD-1 ／ PD-L1单抗药物出现不良反应、耐药等问题，且对全部肿瘤的有效率仅为25% ～30%［3］。因此，目前全球有大量提高PD-1 ／ PD-L1 单抗药物疗效、降低其临床不良反应方法的相关研究［4-7］。据国家癌症中心《2017中国肿瘤的现状和趋势》报告显示，肝癌在我国肿瘤发病率和死亡率中均排前3 名，因此，基于PD-1 ／PD-L1 单抗药物在肝癌中的防治研究具有重要意义。动物肿瘤模型广泛应用于肿瘤免疫治疗研究，尤其是小鼠肿瘤模型［8］。小鼠H22 细胞型肝癌模型是1952 年由苏联医学科学院肿瘤研究所发明，属于皮下传代肝脏实体瘤［9］。该模型目前广泛用于中药、纳米药物、各类生物制剂等抗肿瘤药物药理以及肝癌发病相关机制的研究，如片仔癀、藤茶总黄酮固体脂质纳米粒和基质金属蛋白酶特异性抑制剂在抗肝癌中应用的研究［10-12］。本研究通过考察该模型中T 细胞亚群浸润和表型特点，结合对PD-1 单抗治疗的反应性，探讨该模型用于PD-1 单抗治疗肿瘤研究的可行性，为基于PD-1 的单抗药物在肝癌治疗上的相关研究提供模型参考。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 SPF 级 BALB ／ c 小鼠，18 只，雄性，6 ~ 8 周龄，18 ~ 22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0010，饲养于广东药科大学实验动物中心SPF 级实验室。本实验均以科研为目的进行小鼠的养殖和使用，且经广东药科大学动物伦理委员会审查批准，并按科技部《关于善待实验动物的指导性意见》、《广东省实验动物管理条例》等相关规定进行（国科发财字［2006］398 号、广东省第十一届人民代表大会常务委员会公告［41 号］）。

1. 2 细胞 H22 细胞由广州中医药大学周联教授惠赠，制备肝癌移植瘤模型前经KM 小鼠腹腔传代培养。

1. 3 主要试剂及仪器 流式检测抗体（包括PE／CY7标记的 CD3 单抗、PE ／ CY5 标记的 CD8 和 CD25 单抗、FITC 标记的 CD4 单抗、PE 标记的 PD-1 单抗）购自美国eBioscience 公司；小鼠淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；胶原酶Ⅳ和DNA 酶购自美国Sigma 公司；治疗用PD-1 单抗购自美国BioXcell 公司；FACS CantoTMⅡ流式细胞仪购自美国BD 公司。

1. 4 动物造模、分组及给药 以H22 肝癌移植瘤模型为研究对象。经小鼠右侧前肢皮下接种2 ×107个 ／ mL 的 H22 细胞悬液，0. 1 mL ／ 只，30 min内接种完毕，4 d 后小鼠肿瘤形成即可供后续试验使用。为考察小鼠肿瘤组织中T 细胞浸润和表型，于小鼠接种肿瘤14 d 后，取肿瘤组织分离淋巴细胞进行流式细胞术检测。为考察肿瘤小鼠对PD-1 单抗治疗的响应，将小鼠分为模型组和PD-1 单抗治疗组（以下简称治疗组），每组6 只。以小鼠分组当天计为实验第1 天。其中治疗组分别在分组后的第4、7、10天给予腹腔注射PD-1 单抗，药物剂量参考文献［13］用量，为 200 μg ／ 只；模型组给予等量生理盐水。末次给药后第3 天取材检测。

1. 5 肿瘤生长情况的观察 从动物分组即开始用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，每2 d 测量1 次，按下式计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。

肿瘤体积（mm3）＝（肿瘤长径 × 肿瘤短径2）／ 2

1. 6 肿瘤浸润淋巴细胞的制备 剪除肿瘤表面皮毛，剥离肿瘤，剪成1 mm3大小碎块，加入胶原酶Ⅳ和 DNA 酶，37 ℃消化 2 h；消化后组织在 200 目不锈钢网上研磨、过滤后，收集细胞悬液至离心管，DHank’s 液离心洗涤细胞 2 次（200 × g 离心 5 min），经淋巴细胞分离液分离并收集肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs），再次离心洗涤2 次后备用。

1. 7 脾脏淋巴细胞的制备 摘取小鼠脾脏，经200目不锈钢筛网研磨、过滤，收集细胞悬液，D-Hank’s液离心洗涤细胞 2 次（200 × g 离心 5 min），经淋巴细胞分离液分离并收集淋巴细胞，再次离心洗涤2次后备用。

1. 8 T 淋巴细胞表型的检测 采用流式细胞术。取TILs 和脾淋巴细胞悬液，按流式抗体试剂说明书进行细胞的荧光染色，抗体包括PE ／ CY7-CD3 单抗、PE ／ CY5-CD8 单抗和 PE ／ CY5-CD25 单抗、FITC-CD4 单抗及PE-PD-1 单抗。细胞染色并经PBS 离心洗涤后，加入300 μL PBS 重悬，采用FACS CantoTMⅡ检测细胞表型。

1. 9 统计学分析 运用SPSS 19. 0 软件进行统计学分析，结果以均数 ± 标准差（Mean ± SD）表示，两组间均数比较采用非配对t 检验，以P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 肝癌小鼠肿瘤组织中T 细胞浸润情况 小鼠肿瘤组织中有CD3+TILs 即T 细胞浸润，占TILs 的（33. 7 ± 1. 5）%，进一步分析发现，在 T 细胞中有（22. 4 ± 0. 9）%是 CD8+T 细胞，见图 1。

图1 流式细胞术分析T 细胞在肿瘤中的浸润情况（Mean ± SD，n = 6）Fig. 1 Flow cytometry of T cell infiltration in tumor（Mean ± SD，n = 6）

肝癌小鼠肿瘤组织中CD4+CD25+T 细胞比例为（24.0±2.3）%，脾脏组织中比例为（13.9±1.7）%，两者间差异有统计学意义（t = 8. 676，P < 0. 01），见图2。

图2 肿瘤组织和脾脏组织中CD4+CD25+T 细胞比例（Mean ± SD，n = 6）Fig. 2 Proportions of CD4+CD25+T cells in tumor and spleen tissues（Mean ± SD，n = 6）

2. 2 肝癌小鼠肿瘤组织中T 细胞表达PD-1 分子的情况 肿瘤组织中CD8+T 和CD4+T 细胞表达PD-1分子比例分别为（28. 6 ± 8. 7）%和（26. 0 ± 4. 6）%，脾脏组织中CD8+T 和CD4+T 细胞表达PD-1 分子比例分别为（4. 3 ± 0. 7）%和（17. 2 ± 3. 8）%；两组织T 细胞亚群表达PD-1 分子的差异均有统计学意义（PD-1+CD8+T 细胞比较：t = 7. 842，PD-1+CD4+T细胞比较：t = 4. 118；P 均 ＜ 0. 01）。见图 3。在肝癌移植瘤模型中，肿瘤浸润T 细胞表达高水平PD-1 分子，提示该模型可能对PD-1 单抗治疗具有响应性。

图3 肿瘤组织和脾脏组织中T 细胞表达PD-1 分子情况（Mean ± SD，n = 6）Fig. 3 Expression levels of PD-1 in T cells from tumor and spleen tissues（Mean ± SD，n = 6）

2. 3 PD-1 单抗对肝癌小鼠移植瘤生长的影响 试验开始时，模型组和治疗组小鼠肿瘤大小无显著差异；初次注射PD-1 单抗后，治疗组小鼠肿瘤生长速度较模型组减缓；至第13 天，治疗组小鼠肿瘤体积显著小于模型组小鼠，差异有统计学意义（t=4. 846，P < 0. 05）。见图 4、图 5 和表 1。

图4 各组小鼠肿瘤组织的观察Fig. 4 Observation of tumor tissues of mice in various groups

图5 小鼠肿瘤生长曲线（Mean ± SD，n = 6）Fig. 5 Tumor growth curve of tumor-bearing mice（Mean ±SD，n = 6）

表1 PD-1 单抗对小鼠H22 肝癌移植瘤生长的影响Tab. 1 Effects of PD-1 McAb on growth of transplanted H22 hepatocellular carcinoma in mice

3 讨 论

为了探讨小鼠H22 肝癌移植瘤模型用于PD-1单抗治疗肿瘤相关研究的可行性，本研究考察了该模型肿瘤组织中T 细胞浸润、表型以及其对PD-1 单抗治疗的响应情况，结果显示，在H22 肝癌移植瘤中有 CD8+T 细胞、CD4+T 细胞及 Tregs 浸润，且CD8+T 和CD4+T 细胞表达高水平的PD-1 分子；同时PD-1 单抗治疗可抑制小鼠H22 肝癌移植瘤生长。表明小鼠H22 肝癌移植瘤模型用于PD-1 单抗治疗肿瘤的研究具有可行性；同时由于H22 肝癌模型小鼠肿瘤组织中浸润T 细胞包括CD8+T 细胞、CD4+T 细胞和Tregs，推测该模型适用基于T 细胞的肿瘤免疫治疗研究。

T 细胞在肿瘤组织浸润是基于T 细胞的肿瘤免疫治疗（包括 PD-1 ／ PD-L1 单抗、过继 T 细胞疗法、CTLA-4 单抗等）作用的前提，因此，本研究首先检测了T 细胞在H22 肝癌移植瘤模型肿瘤组织中的浸润情况。T 细胞主要由CD8+T 和CD4+T 细胞组成［1］，这两群T 细胞在肿瘤免疫中扮演着不同角色：CD8+T 细胞受抗原刺激后可分化为细胞毒性T细胞，具有杀伤肿瘤细胞的功能［14-15］；CD4+T 细胞中的辅助性T 细胞辅助CD8+T 细胞活化，具有免疫调节功能的亚群即Tregs 则参与肿瘤免疫抑制微环境形成［14］，该群细胞表达高水平的 CD25 分子［16］。本研究发现，在H22 肝癌移植瘤浸润的淋巴细胞有一部分是T 细胞，包括CD8+T 和CD4+T 细胞。肿瘤组织T 细胞浸润水平不但是基于T 细胞免疫治疗的前提，而且也是判断肝癌预后的重要指标［17］。在本研究中，H22 肝癌组织有T 细胞浸润，提示该模型用于PD-1 单抗治疗具有可行性。此外，肿瘤组织中CD4+CD25+T 细胞比例远高于脾脏组织，且该群细胞中几乎均是Tregs［14］，也提示了在H22 肝癌组织中有大量的Tregs 浸润。上述结果表明，H22 肝癌移植瘤模型可能适用于PD-1 单抗、CTLA-4 单抗和过继T 细胞疗法等免疫治疗研究。

为了进一步证明该模型应用于PD-1 单抗治疗的可行性，本研究还考察了肿瘤浸润T 细胞表达PD-1分子的情况。这是由于肿瘤对PD-1 单抗治疗响应还需浸润T 细胞表达高水平PD-1 分子，该分子也是T 细胞功能耗竭的表现［18-19］。一般情况下，受抗原刺激而活化的T 细胞随后会上调以PD-1 分子为代表的多种共抑制性分子，通过这些分子的负反馈作用使免疫应答维持适度［20］。PD-1 分子通过与配体PD-L1 和PD-L2 结合，可诱导T 细胞凋亡，从而抑制T 细胞效应功能，有利于维持自身免疫耐受［21］。但上述负反馈调节机制在肿瘤组织中却能帮助肿瘤细胞逃避细胞毒性T 细胞的杀伤，这是因为肿瘤细胞通过表达高水平PD-L1 分子与T 细胞表面的PD-1分子结合产生抑制性信号，使T 细胞不能有效杀伤肿瘤细胞［22-23］。抗 PD-1 ／ PD-L1 单抗药物通过阻断表达在T 细胞表面的PD-1 与表达在肿瘤细胞表面的配体PD-L1 结合，使T 细胞能正常识别并攻击肿瘤细胞，即恢复机体抗肿瘤免疫应答［24-25］。本研究发现，肿瘤组织中CD8+T 和CD4+T 细胞表达PD-1分子水平明显高于脾脏组织。有研究已报道，人肝癌肿瘤组织中T 细胞表达PD-1 分子水平显著高于非肿瘤组织［26-27］，且肿瘤对PD-1 单抗的响应与PD-1分子表达水平密切相关［28］。因此，本研究结果与过往研究具有高度一致性，推测该模型很可能适用于PD-1 单抗的肿瘤免疫治疗研究。为了证明该假设，本研究最后考察了PD-1 单抗对H22 肝癌移植瘤生长的影响，结果显示，PD-1 单抗干预能有效抑制肝癌小鼠移植瘤生长，即该模型对PD-1 单抗治疗具有较好的响应。

综上所述，本研究结果证明了小鼠H22 肝癌移植瘤模型可用于PD-1 单抗的肝癌免疫治疗研究。此外，由于该肿瘤模型中具有较多T 细胞和Tregs浸润，可能也适用于过继T 细胞疗法和CTLA-4 单抗等基于T 细胞的免疫疗法。