结核分枝杆菌Rv1886c 蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

刘琼，李慧，罗鹏征，马国荣，张炜，万巧凤

宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，宁夏 银川 750004

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）感染所致的一种慢性传染病，是当今世界由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病［1］。据WHO 统计，全球结核潜伏感染人群接近20 亿，仅2019 年全球约有患者1 000万人，140 万人死于 TB［2］。我国新发 TB 患者约占全球第3 位（8. 4%），仅次于印度（26%）和印度尼西亚（8. 5%）［2］。因此，尽早发现 TB 患者并给予有效治疗是控制TB 播散的关键。

目前，用于TB 诊断的方法有X 光检查、病原学检测（痰液抗酸染色法及细菌培养法）、结核菌素（purified protein derivative，PPD）皮肤试验及 TB 核酸序列扩增技术等。病原学检测是TB 诊断的金标准，我国的M. tb 病原学诊断率较低，2020 年WHO报告显示，我国TB 病原学阳性率为47%，低于全世界57%的检出率［2］，仅靠此法会延误对患者的治疗［3］；PPD 皮试是一种免疫学检测方法，具有操作简单的优势，但难以区分卡介苗的免疫效果及致病性 M. tb 的感染，因此诊断价值不高［4］；在 TB 早期诊断中，核酸扩增技术是病原学诊断的重要补充，但因其成本高及对检测环境的严格要求，限制了其在基层医院的应用［5］。血清学检测具有操作简便、灵敏度高、适用于肺外结核和肺结核等优势［6］。因此，获得高灵敏度、高特异性的M. tb 抗原或抗体，并将其应用于血清学检测TB，是早期诊断TB 的理想方法。

本研究通过构建表达M. tb 早期分泌性蛋白Rv1886c 基因的重组质粒，转化E.coli 后诱导高表达Rv1886c 蛋白（Ag85B），并免疫小鼠制备多克隆抗体，旨在为采用血清学方法早期诊断TB 奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 菌株、质粒及基因组 克隆和表达菌株E. coli DH5α 和 BL21（DE3）、pET-28a 质粒及 M. tb（H37Rv）基因组均由马国荣老师惠赠。

1. 2 实验动物 SPF 级 BALB ／ c 小鼠，雄性，7 ～ 8周龄，体重（21 ± 1. 6）g，共 10 只，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2016-0006。本实验对BALB ／ c 小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照宁夏医科大学动物伦理相关规定进行（2021-N019）。

1. 3 主要试剂 TaqDNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶购自日本TaKaRa 公司；限制性内切酶 HindⅢ和BamHⅠ购自美国NEB 公司；硫酸卡那霉素（Kan）、IPTG、琼脂糖、胰化蛋白胨及酵母提取物均购自宁夏科博生物科技有限公司；质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗Ag85B 单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP 标记的兔抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；含Ni+螯合剂的Ni-NTA His纯化试剂盒购自美国Invintrogen 公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1. 4 目的基因 Rv1886c 的扩增 以 M. tb（H37Rv）的DNA 为模板，根据GenBank 中注册的M. tb Rv1886c基因（Gene ID：885785）序列设计引物，P1：5′-CCCAAGCTTATGACAGACGTGAGCCGAAAGA-3′（下 划线部分为 Hind Ⅲ酶切位点），P2：5′-CGGGATCCTCAGCCGGCGCCTAACGAA-3（′下划线部分为BamHⅠ酶切位点），基因全长为977 bp。PCR 反应体系：Premix Taq 25 μL，DNA 2 μL，P1、P2 引物各 1 μL，加水至 50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。回收PCR 产物，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1. 5 重组表达质粒的构建 用T4 DNA 连接酶将PCR 产物与 pET-28a 质粒连接，转化 E. coli DH5α。随机挑取 5 个菌落，接种于含 50 μg ／ mL 硫酸卡那霉素的LB 培养液中，37 ℃振荡培养12 h 后提取质粒DNA，用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切鉴定，阳性克隆送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。将获得的含有Rv1886c 基因的表达质粒命名为pET-28a-Rv1886c。

1. 6 重组蛋白表达菌株的构建 将重组表达质粒pET-28a-Rv1886c 通过热激法转化入E. coli BL21（DE3）中，命名为 BL-Rv1886c，于-80 ℃保存。

1. 7 重组Rv1886c 蛋白诱导表达条件的优化

1. 7. 1 诱导剂浓度 将冻存的BL-Rv1886c 菌株接种于 20 mL 含 100 μg ／ mL Amp 的 LB 液体培养基中，恒温摇床 200 r ／ min，37 ℃培养过夜；再按 2%比例转种至200 mL LB 培养基中，振荡培养至菌液A600为 0. 4 ～ 0. 6 时，分别加入 0. 2、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 和 3. 0 mmol ／ L IPTG，37 ℃诱导 4 h。各取 2 mL菌液制备蛋白样品，进行12% SDS-PAGE 分析，确定最佳诱导剂浓度。

1. 7. 2 诱导时间 BL-Rv1886c 表达菌培养至菌液A600为 0.4 ～ 0.6 时，加入 0.5 mmol／L IPTG，37 ℃分别诱导 2、4、6、8 h。各取 2 mL 菌液制备蛋白样品，进行12% SDS-PAGE 分析，确定最佳诱导时间。

1. 7. 3 诱导温度 BL-Rv1886c 表达菌培养至菌液A600为 0. 4 ～ 0. 6 时，加入 0. 5 mmol ／ L IPTG，分别于27、30、37 ℃诱导4 h。收集菌液制备蛋白样品，进行12% SDS-PAGE 分析，确定最佳诱导温度。

1. 8 重组蛋白的分离纯化 采用Ni-NTA His 纯化试剂盒纯化目的蛋白。将诱导后的菌液离心、制备上柱样品，按照说明书中的方法进行亲和色谱纯化。收集洗脱液，加入透析袋中，于4 ℃低温下进行梯度透析复性，每4 ～8 h 换液1 次，透析48 h 后回收复性蛋白，BCA 定量法测定蛋白浓度。保存于-20 ℃备用。

1. 9 重组蛋白的Western blot 分析 分别取重组蛋白 10 和 40 μg，按 1 ∶4 体积比加入 5 × 样品缓冲液，沸水浴5 min 后上样，经12% SDS-PAGE 分离后，半干电转膜仪转移至PVDF 膜上，以5%脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜；TBST 洗膜 10 min，共 3 次，加入鼠抗 Ag85B 单克隆抗体（1 ∶1 000 稀释），37 ℃孵育l h；加入 HRP 标记的兔抗鼠 IgG（1 ∶1 000 稀释），37 ℃振荡 60 min；加入 ECL 发光液，X 线胶片曝光，经显影、定影后分析结果。

1. 10 抗小鼠血清的制备 将纯化的Ag85B 蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分混合形成油包水乳化剂，经小鼠背部皮下注射，300 μL ／ 只，共 7 只；对照组 3只小鼠注射0. 9%氯化钠溶液与等体积弗氏完全佐剂充分混合的乳化剂。每周免疫1 次，共4 次，除初次免疫外，其余3 次使用弗氏不完全佐剂，于第4 次免疫后1 周经眼框后静脉丛采血，分离血清。

1. 11 抗体滴度检测 采用间接ELISA 法。将纯化的 Ag85B 蛋白配制成 2 μg ／ mL 的溶液包被 96 孔酶标板，0. 1 mL ／ 孔，4 ℃过夜；加入 2% BSA 封闭液，0. 1 mL ／ 孔，37 ℃静置 2 h；TBST 洗板 4 次，加入 2 倍稀释的免疫血清（终浓度为 1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200、1 ∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600、1 ∶51 200、1 ∶102 400），第 1 列设 PBS 阴性对照，37 ℃孵育l h；加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1 ∶1 000 稀释），0. 1 mL ／ 孔，37 ℃温育 40 min；PBST 洗板，加入底物，0. 1 mL ／ 孔，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入 50 μL 2 mol ／ L H2SO4终止反应，于酶标仪上测定A450值。以试验孔A450值 ／ 阴性对照A450值＞2. 1 倍的最高样品稀释度定义为抗体滴度［1］。

1. 12 抗体特异性鉴定 采用Western blot 法。取纯化的Ag85B 蛋白，经12% SDS-PAGE 分离后，电转移至PVDF 膜上，以5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；TBST 洗膜3 次，加入制备的鼠抗血清（稀释梯度依次为 1 ∶1 000、1 ∶5 000、1 ∶25 000），室温孵育 2 h；TBST 洗膜 3 次，加入 HRP 标记的兔抗鼠 IgG（1 ∶1 000 稀释），室温孵育 1 h；TBST 洗膜 3 次，采用 ECL显色观察。

2 结 果

2. 1 Rv1886c 基因扩增产物的鉴定 Rv1886c 基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约1 000 bp处可见特异性条带，大小与预期（977 bp）相符，见图1。

图1 Rv1886c 基因扩增产物电泳图Fig. 1 PCR amplification of Rv1886c gene

2. 2 重组表达质粒的酶切鉴定 重组表达质粒pET-28a-Rv1886c 的双酶切（Hind Ⅲ和 BamHⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见与扩增条带大小一致的条带，见图2。基因测序结果与 GenBank 中公布的M. tb Rv1886c 基因序列完全一致，表明质粒构建正确。

图2 重组表达质粒pET-28a-Rv1886c 的酶切鉴定Fig. 2 Identification of the pET-28a-Rv1886c vector through restriction enzyme digestion

2. 3 重组Rv1886c 蛋白诱导表达条件的优化

2. 3. 1 最佳诱导剂浓度 12%SDS-PAGE 分析显示，在诱导剂浓度为 0. 2 ～ 2 mml ／ L 时，Ag85B 重组蛋白表达量较高，但诱导剂浓度为0. 2 mml ／ L 时，杂蛋白较多，因此选择最佳诱导剂浓度为0.5 mmol／L。见图3。

图3 37 ℃下不同浓度IPTG 诱导4 h 表达产物的SDSPAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced with IPTG in different concentrations at 37 ℃for 4 h

2. 3. 2 最佳诱导时间 12% SDS-PAGE 分析显示，诱导8 h，Ag85B 重组蛋白表达量最高，但杂带较多；诱导4 和6 h，Ag85B 重组蛋白表达量高且杂带较少，因此确定最佳诱导时间为4 h。见图4。

图4 37 ℃下0. 5 mmol ／ L IPTG 诱导不同时间表达产物的SDS-PAGE 分析Fig. 4 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced by 0. 5 mmol ／ L IPTG at 37 ℃ for different time periods

2. 3. 3 最佳诱导温度 12% SDS-PAGE 分析显示，诱导温度为37 ℃时，Ag85B 重组蛋白表达量最高，因此确定最佳诱导温度为37 ℃。见图5。

图5 0. 5 mmol ／ L IPTG 于不同温度下诱导 4 h 表达产物的SDS-PAGE 分析Fig. 5 SDS-PAGE results of proteins expressed in transformed E. coli induced by 0. 5mmol ／ L IPTG at different temperatures

2. 4 纯化重组蛋白的鉴定

2. 4. 1 SDS-PAGE 分析 纯化重组蛋白的纯度达90%以上，蛋白浓度约为1. 5 mg ／ mL，可用于动物免疫。见图6。

图6 纯化重组蛋白的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS-PAGE results of purified recombinant protein

2. 4. 2 Western blot 分析 纯化的重组蛋白可与Ag85B单克隆抗体反应，在相对分子质量约30 000 处可见特异条带，见图7。

图7 纯化重组蛋白的Western blot 分析Fig. 7 Western blotting results of purified recombinant protein

2. 5 小鼠血清抗体效价 间接ELISA 结果显示，小鼠血清抗体滴度高达1︰51 200，见图8。

图8 间接ELISA 法测定血清Ag85B 抗体滴度Fig. 8 Determination of serous Ag85B antibody titer through indirect ELISA

2. 6 Ag85B 多克隆抗体的特异性 Western blot 分析显示，在相对分子质量约30 000 处可见明显条带，且在稀释浓度为1︰25 000 条件下也可发生特异性反应。见图9。

图9 Western blot 鉴定不同稀释度的抗Ag85B 血清Fig. 9 Identification of anti Ag85B sera with different dilutions through Western blotting

3 讨 论

《“十三五”全国结核病防治规划》明确提出了规划目标：2020 年我国肺结核发病和死亡人数进一步减少，全国肺结核发病率下降至58 ／ 10 万以下，肺结核患者病原学阳性率达50%以上［7］。2020 年我国已基本完成规划目标［8］。WHO 和我国对诊断TB 的技术规范进行了推荐［9-10］，TB 的诊断技术需因地施策和规范应用才能发挥其功效，不应盲目寻求新方法，更不能忽略经典的TB 病原学及血清学检查［11］。

M. tb 的分泌性蛋白是刺激宿主免疫系统产生免疫效应的外源性抗原，是诊断TB 的标志分子［12］。Ag85 复合物是常见的M. tb 分泌蛋白，占M. tb 分泌蛋白总量的45%，该复合物包括Ag85A、Ag85B 和Ag85C 3 种组分，其中 Ag85B 占 22%，Ag85A 占15%，Ag85C 占8%［13］。因Ag85 复合物可诱导强烈的 Th1型细胞免疫应答，该复合物尤其Ag85A 和Ag85B 是最有前景的TB 疫苗候选抗原［14］。Ag85B 是由M. tb Rv1886c 基因编码的相对分子质量为30 000 的早期分泌性蛋白。Rv1886c 编码的约40 个氨基酸的前导序列在分泌时被切除，然后Ag85B 释放到M. tb菌体外，因此在M. tb 培养滤液中，第3 天即可检测到 Ag85B［15］。又由于 Ag85B 的分泌量高于 Ag85A，因此Ag85B 有望成为TB 的血清学早期诊断标志物。

本研究成功地对Rv1886c 基因进行克隆及表达。通过优化条件，获得了较高纯度的重组蛋白Ag85B，该蛋白可有效刺激小鼠产生体液免疫应答，抗体滴度达1︰51 200。以纯化的Ag85B 蛋白为抗原，抗血清为一抗进行Western blot，在相对分子质量约30 000处可见明显条带，且在抗血清稀释浓度为1︰25 000条件下，Ag85B 与其抗血清也能发生特异性反应，表明Ag85B 与其抗血清结合具有高灵敏度和特异性，可作为TB 血清学诊断的候选抗原分子。本研究为TB 的血清学早期诊断奠定了基础。