长效生长激素相关蛋白含量检测反相高效液相色谱法的建立及验证

赵鑫，俞露，孙瑞欣，朱秋媚，王江林，刘涵，刘玉林，刘景会，邹勇

长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室，吉林 长春 130012

长效生长激素（recombinant human growth hormone-Fc，rhGH-Fc）免疫融合蛋白是利用一段柔软多肽将人生长激素与IgG4 Fc 片段相连，将基因克隆至GS 双表达载体，再利用CHO-k1 细胞进行表达的一种Fc 融合蛋白［1］。rhGH-Fc 融合蛋白具有与生长激素相同的生理作用，同时拥有较长的半衰期［2］。相较短效生长激素，rhGH-Fc 可减少用药次数，提高患者依从性，从而提高治疗效果［3］。国内的长效生长激素均为PEG 化生长激素，而Fc 融合蛋白除了可通过增大药物相对分子质量降低清除率，还可通过FcRn 结合域来提高pH 敏感性结合力，以缓释的方式延长药物半衰期。与PEG 化药物相比，Fc 融合蛋白不仅具有更长的药物半衰期，而且具有更好的生物相容性。

相关蛋白是蛋白质在物理、化学作用下，由于蛋白聚集或某些氨基酸侧链发生氧化、脱酰胺等化学修饰反应［4］，产生的与原蛋白质结构类似，但物理、化学性质又与原蛋白质存在差异的一类蛋白。氧化和脱酰胺反应是rhGH-Fc 最容易发生的降解反应，脱酰胺反应主要是 Asn ／ Glu（天冬酰胺 ／ 谷氨酸）在临近氨基酸α 碳亲核攻击下脱掉酰胺基水解成Asp ／ Glu（天冬氨酸 ／ 谷氨酸）残基［5］，氧化反应主要是由于Met 位点中的含硫基团易被空气中氧气氧化［6］。研究表明，蛋白质的生物学活性会受蛋白结构影响［7］，相关蛋白产物也可能会影响蛋白质的免疫原性［8］。蛋白质相关蛋白的含量变化既可体现部分蛋白质结构的变化，同时也反映了蛋白质的稳定程度，因此，建立稳定、准确的相关蛋白检测方法至关重要。

本研究建立了rhGH-Fc 相关蛋白含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，并对建立的方法进行验证。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂及仪器 rhGH-Fc 蛋白纯化液（CHOK1 细胞表达）由长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室制备，批号分别为S190826、S191031 和S191112；乙腈（LC ／ MS）购自美国 Honeywell 公司；甲酸（LC ／ MS）购自美国 Fisher 公司；盐酸胍购自美国 Gibco 公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）购自美国 Promega 公司；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）购自美国Sigma 公司；碳酸氢铵、硫酸铵和乙腈（高效液相淋洗）购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自湖南九典制药有限公司；超滤管和0. 22 μm 无菌滤膜购自美国Millpore 公司；AcQuity 液相色谱系统、G2-XS 精确质量四级杆飞行时间（Q-TOF）液质联用系统、Xevo G2 OTof 质谱仪、UNIFI 软件及 BEH C18色谱柱（130 Å 1. 7 μm，2. 1 mm × 100 mm）购自美国Waters 公司；PerkinElmer Flexa 型高效液相色谱系统（配有UV／VIS 检测器、自动进样器、往复式柱塞泵、TCNav 色谱工作站、柱温箱）购自美国PerkinElmer公司；ZORBAX 300SB-C18（4. 6 mm × 250 mm，5-Micron）色谱柱购自美国Agilent 公司；G-25 色谱柱购自美国GE 公司。

1. 2 样品配制

1. 2. 1 对照品溶液 向rhGH-Fc 原液中缓慢加入45%饱和度的硫酸铵（按25 ℃硫酸铵饱和度计算表），并不断搅拌，直至硫酸铵全部溶解，4 ℃静置30 min；7 200 × g 离心 30 min；弃上清，得到蛋白沉淀，用冷注射用水复溶，7 200 × g 离心 20 min；弃沉淀，上清液经 5 mmol ／ L PB 缓冲液（pH 7. 0）平衡好的 G-25色谱柱纯化，得到缓冲液为 5 mmol ／ L PB（pH 7. 0）、蛋白浓度为 1 mg ／ mL 的蛋白样品，作为 rhGH-Fc 对照品溶液，于-20 ℃保存。

1. 2. 2 氧化加速试验样品 向rhGH-Fc 对照品溶液中加入0. 1%过氧化氢，用0. 22 μm 无菌滤膜滤至灭菌西林瓶中，4 ℃放置48 h。

1. 2. 3 脱酰胺加速试验样品 将rhGH-Fc 对照品溶液用0. 22 μm 无菌滤膜滤至灭菌西林瓶中，37 ℃放置6 d。

1. 3 rhGH-Fc 相关蛋白结构解析

1. 3. 1 样品处理 取对照品溶液、氧化加速试验样品、脱酰胺加速试验样品各150 μL，分别按以下步骤处理：加入 300 μL 盐酸胍（8 mol ／ L），加入 2 μL DTT（1 mol ／ L），50 ℃水浴 30 min；放至室温，加入4 μL IAM（1 mol ／ L），避光 30 min；加至超滤管中，12 000 × g 离心 5 min，弃膜下液，加入 50 mmol ／ L NH4HCO（3pH 8. 0）缓冲液置换，重复离心步骤15次；用置换用缓冲液将样品浓度调至0. 3 mg ／ mL，按15 ∶1 的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶切4. 5 h。

1. 3. 2 质谱检测方法 用Waters Xevo G2 QTof 质谱仪，色谱柱为 BEH C18（130 Å 1. 7 μm，2. 1 mm ×100 mm）；流动相A 为水 + 0. 1%甲酸，流动相B 为乙腈+0.1%甲酸；柱温为65 ℃；流速为0.3 mL／min；样品保存温度为10 ℃；上样量为1. 5 μg。按下述线性梯度洗脱程序检测：0 ~ 2 min，100% A；2 ~32 min，100% A→60% A；32 ~ 33 min，60% A→5%A；33 ~ 39 min，5% A。

1. 4 方法优化

1. 4. 1 梯度洗脱方法 色谱条件：色谱柱ZORBAX 300SB-C18（4. 6 mm × 250 mm，5-Micron）；流动相 A为水+0.1%TFA，流动相B 为乙腈+0.1%TFA；柱温为 45 ℃；流速为 0. 7 mL ／ min；上样量为 40 μg；检测波长为280 nm。梯度洗脱方法如下：①：0~40 min，30% B→100% B。②：0 ~ 40 min，35% B→80% B；③：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~ 40 min，55%B→80% B。④：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~40 min，55% B→75% B。⑤：0 ~ 10 min，35% B→55%B；10~50 min，55%B→75%B。⑥：0~10 min，45% B→55% B；10 ~ 40 min，55% B→65% B。

1. 4. 2 流动相 色谱条件：色谱柱ZORBAX 300SBC18（4.6 mm × 250 mm，5-Micron）；柱温为 45 ℃；流速为 0.7 mL ／min；上样量为 40 μg；检测波长为 280 nm。流动相方案1：流动相A 为水 + 0. 1% TFA，流动相B 为乙腈 + 0. 1% TFA；梯度洗脱方法：0 ~ 10 min，35% B→55% B；10 ~ 50 min，55% B→75% B。流动相方案2：流动相A 为30%乙腈 + 0. 1%，流动相B为80%乙腈+0.1%TFA，梯度洗脱方法：0~10 min，10% B→50% B；10 ~ 50 min，50% B→90% B。

1. 5 方法的验证

色谱条件：色谱柱ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×250 mm，5-Micron）；流动相 A 为 30%乙腈 + 0. 1%TFA，流动相B 为80%乙腈 + 0. 1% TFA，梯度洗脱方法为 0 ~ 10 min，10% B→50% B；10 ~ 50 min，50% B→90% B；柱温为 45 ℃；流速为 0. 7 mL ／ min；上样量为40 μg；检测波长280 nm。

1. 5. 1 系统适应性 取rhGH-Fc 对照品1 mL，按色谱条件进样检测，计算理论塔板数、拖尾因子、主蛋白与相关蛋白分离度。

1. 5. 2 重复性 取rhGH-Fc 对照品1 mL，按色谱条件进样检测，重复进样6 次，记录主峰比例，主峰峰面积，计算平均值和相对标准偏差（RSD）。

1. 5. 3 专属性 取rhGH-Fc 对照品和5 mmol ／ L PB缓冲液（pH 7. 0）各1 mL，分别按色谱条件进样检测。

1. 5. 4 耐用性 两台相同型号高效液相色谱仪，记为设备1 和2；按照配方配制2 批流动相，记为流动相1 和2；取2 根相同型号，使用程度不同的色谱柱，记为色谱柱1 和2；设置柱温箱温度为40、45 和50 ℃。不同条件下进样检测，记录主峰纯度，计算平均值和RSD。

1. 5. 5 检测限及定量限 将样品稀释5 个梯度，浓度分别为 0. 1、0. 05、0. 025、0. 01、0. 005 mg ／ mL，按色谱条件进样检测，记录信噪比（S ／ N），检测限S ／ N 不小于 3，定量限 S ／ N 不小于 10。

1. 6 rhGH-Fc 氧化产物及脱酰胺产物的检测 用建立的相关蛋白检测方法对rhGH-Fc 氧化加速试验样品和脱酰胺加速试验样品进行检测，并与rhGH-Fc对照品图谱进行比较。

1. 7 rhGH-Fc 相关蛋白检测方法的初步应用 用建立的相关蛋白检测方法对本室纯化的不同批次rhGH-Fc 纯化液进行检测，并分析检测结果。

2 结 果

2. 1 rhGH-Fc 相关蛋白结构 通过质谱肽图分析，rhGH-Fc 的主要脱酰胺位点为第299 和368 位的天冬酰胺残基；rhGH-Fc 的主要氧化位点除了与短效生长激素相同的第14、125 位甲硫氨酸外，在第236 和342 位的甲硫氨酸处也容易发生氧化反应。见图1 和表1。

表1 rhGH-Fc 主要氧化和脱酰胺位点Tab. 1 Major oxidation and deamidation sites of rhGH-Fc

图1 rhGH-Fc 质谱肽图检测Fig. 1 Mass spectrometry peptide mapping of rhGH-Fc

2. 2 方法优化的结果 梯度洗脱方法⑤较梯度洗脱方法①、②、③、④分离度更高，分离效果好；较梯度洗脱方法⑥峰型更对称，出峰时间更合理。见图2。因此，选则梯度洗脱方法⑤为rhGH-Fc 相关蛋白含量检测的梯度洗脱方法。流动相方案2 较1 分离度有所提高，峰型更对称，见图3。因此，选则流动相方案2 为rhGH-Fc 相关蛋白含量检测的流动相方案。

图2 各洗脱方法的对比图Fig. 2 Comparison of various elution methods

2. 3 方法的验证结果

2. 3. 1 系统适应性 结果显示，主峰理论塔板数为13 919，拖尾因子为1. 4，主蛋白与相关蛋白分离度为1. 9，符合《中国药典》二部（2015 版）重组人生长激素相关蛋白质项目中拖尾因子0. 9 ~ 1. 8，分离度大于1. 0 的要求。见图3。

图3 rhGH-Fc 相关蛋白检测方法的优化及系统适应性验证Fig. 3 Optimization of determination method for rhGH-Fc associated protein and verification for system adaptability

2. 3. 2 重复性 结果显示，对照品主峰纯度平均值为96. 51%，RSD 为0. 22%，主峰峰面积平均值为3 286 333. 38，RSD 为 1. 8%，符合《中国药典》四部（2015 版）0512 HPLC 法中 RSD 小于 2%的要求。见表2。

表2 重复性验证结果Tab. 2 Verification for reproducibility

2. 3. 3 专属性 结果表明，PB 缓冲液在蛋白出峰时间未出峰，对蛋白纯度检测无干扰，见图4。表明该方法专属性良好。

图4 专属性验证结果Fig. 4 Verification for specificity

2. 3. 4 耐用性 结果显示，相同色谱柱条件下，不同设备、不同批次流动相、不同柱温对检测结果无明显影响；主峰纯度平均值为96. 64%，RSD 为0. 05%。见表3。

表3 耐用性验证结果Tab. 3 Verification for durability

2. 3. 5 检测限及定量限 结果显示，蛋白浓度为0.01 mg／mL 时，S／N=4，该方法检测限为 0.01 mg／mL；蛋白浓度为 0. 025 mg ／ mL 时，S ／ N = 13，该方法定量限为 0. 025 mg ／ mL。

2. 4 rhGH-Fc 氧化产物及脱酰胺产物分析 结果显示，与对照品溶液相比，rhGH-Fc 氧化加速试验样品及rhGH-Fc 脱酰胺加速试验样品的氧化产物峰和脱酰胺产物峰均明显升高，见图5。表明相较于质谱检测，建立的方法更简便、快速、直观，更适用于日常大量样品的检测。

图5 rhGH-Fc 相关蛋白的HPLC 法检测Fig. 5 Determination of rhGH-Fc associated protein by HPLC

2. 5 rhGH-Fc 相关蛋白检测方法的初步应用 用建立的方法均可快速、灵敏地检测出不同批次rhGHFc 纯化液的相关蛋白含量，见图6。

图6 3 批rhGH-Fc 纯化液相关蛋白检测结果Fig. 6 Determination of three batches of purified rhGH-Fc

3 讨 论

通过质谱结构解析结果发现，rhGH-Fc 存在多个易发生氧化和脱酰胺反应的位点，这些位点除了分布于rhGH 片段上，在Fc 片段上也存在。由于氧化和脱酰胺反应产生的相关蛋白会影响产品质量，在蛋白纯化和制剂开发过程中要对相关蛋白含量加以控制，因此需建立一种快速、便捷的RP-HPLC 检测方法用于药品研究过程的相关蛋白检测。

长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室生产的rhGH-Fc 融合蛋白是真核表达，糖基化修饰复杂，组分较多，在进行相关蛋白检测时，如果采用类似重组人生长激素的等度洗脱方法［9］，当使用甲醇、正丙醇等洗脱强度弱的流动相时，强保留杂质组分可能会滞留在色谱柱上，很难被完全洗脱，所有组分集中在图谱后部，分离度差，峰型不对称，不能准确分析rhGH-Fc 相关蛋白含量；当使用洗脱强度强的乙腈作为流动相时，弱保留杂质组分会在色谱图起始部分一起流出，很难分离所有组分，分析效果差。采用梯度洗脱方法可有效解决上述问题，因此本文设计了乙腈作为流动相的梯度洗脱方法进行rhGH-Fc 相关蛋白含量检测。

影响梯度洗脱的影响因素较多。梯度洗脱陡度影响各组分间的分离度［10］，当梯度陡度较大时，各组分间分离度较差，不能达到《中国药典》二部（2015版）要求，因此可适当放缓梯度陡度来达到更好的分离效果。但如果陡度过缓，既会延长分析时间，也会影响峰型及对称性。若1 个梯度洗脱陡度不能完全分离，可在1 个梯度洗脱中采用2 个不同的梯度陡度使分离度进一步提高［11］。强洗脱溶剂B 的浓度变化范围影响出峰时间，若B 的起始浓度过低，谱图起始比较空旷，无组分峰出现；B 的起始浓度过高，谱图后部比较空旷，表明梯度洗脱未结束全部组分已被洗脱出，较早流出的组分可能产生重叠，降低分离度。优化流动相A、B 中的乙腈浓度可使梯度洗脱过程中的梯度变化更缓和，出峰时间更合理，对于提高分离度和改善峰型均有明显效果。

综上所述，本研究成功建立了rhGH-Fc 相关蛋白含量RP-HPLC 检测方法。经验证，此方法能有效分离本产品相关蛋白，具有较好的系统适应性，且专属性好、耐用性强、检测限低，可满足药品研发过程中RP-HPLC 相关蛋白含量的检测需求。