青海血蜱重组rHq002 蛋白包涵体的纯化

马静 ，陈开廷 ，曹美娜 ，刘玉婷 ，马婧 ，高金亮

1. 包头医学院，内蒙古 包头 014000；2. 鄂尔多斯市中心医院，内蒙 古鄂尔多斯 017000

大肠埃希菌（Escherichia coli）具有遗传背景清楚、价格低廉、易于操作、蛋白表达水平高等优点，被广泛用于重组蛋白的诱导表达［1］。外源基因可在大肠埃希菌中高水平表达具有正确一级结构的重组蛋白，但由于原核细胞与真核细胞内环境的差异会导致蛋白质结构的错误折叠，从而产生没有生物活性且不溶的包涵体。包涵体的形成可能与蛋白质合成过程中的温度、时间、诱导剂浓度等诱导条件有关。有研究表明，如果蛋白质二级结构中存在二硫键，则大肠埃希菌的内环境更容易导致其形成包涵体［2］。但包涵体也具有独特的优点，如在大肠埃希菌中的表达产量高、结构紧密、易于从其他细胞成分中分离，以及不易被降解等特性［3］，这些特性有利于对包涵体蛋白质进行简单的初步提纯。

对包涵体进行变性溶解后复性，可获得具有生物活性的重组蛋白。其具体过程为：将含有包涵体的大肠埃希菌裂解，经低速离心后弃上清液留沉淀，用含洗涤剂的洗涤液洗涤沉淀后获得包涵体粗提物；用增溶剂高浓度盐酸胍或尿素通过破坏蛋白质间的聚集达到增溶重组蛋白的目的；然后复性，通过将增溶剂的浓度降低或者完全清除，使蛋白恢复天然状态。为了提高蛋白的复性效率和减少聚集现象的产生，会添加少量还原剂、小分子聚合物、表面活性剂或者分子伴侣等。

蜱是体外吸血节肢动物，可携带细菌、病毒、立克次体等多种病原体。本实验室在前期研究中从青海血蜱的cDNA 文库中克隆出1 个阳性克隆，其编码的蛋白质含有多个半胱氨酸，可能形成多对二硫键，将该阳性克隆暂命名为Hq002（因申请国家发明专利，序列暂未公布）。BLASTPA 比对发现，其与扇头硬蜱（Rhipicephalus hemaphysaloides）［4］的rhipilin-2 相似。将该阳性克隆的开放阅读框（ORF）插入原核表达载体pET-30a 中，成功构建了重组质粒pET-30a-Hq002。本研究将重组质粒pET-30a-Hq002 转化大肠埃希菌，诱导表达其重组蛋白，通过对该包涵体蛋白进行变性、复性，获得可溶性的重组蛋白质。

1 材料与方法

1. 1 菌株及质粒 重组质粒pET-30a-Hq002 由鄂尔多斯市中心医院分子医学实验室构建；质粒pET-30a（+）购自美国 Novagen 公司；E. coli Rosetta（DE3）购自唯地生物技术有限公司。

1. 2 主要试剂 异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan+）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自博士德生物工程有限公司；彩虹180 广谱蛋白Marker（11-180 kD）购自北京索莱宝科技有限公司；其他常用试剂均为国产分析纯试剂，蛋白纯化树脂Ni-NTA Agrose购自美国Invitrogen 公司。

1. 3 重组蛋白的诱导表达 将重组质粒pET-30a-Hq002转化E. coli Rosetta（DE3），挑取单菌落接种至5 mL LB 培养液（含 50 μg ／ mL Kan+）中，37 ℃，200 r ／ min振摇培养过夜；取1 mL 培养物转接于1 L 2 × YT 培养液（含 50 μg ／ mL Kan+）中，37 ℃，200 r ／ min 振摇培养；至A600达0. 8 ~ 1. 0 时，加入IPTG 至终浓度为 0. 1 mmol ／ L，26 ℃诱导表达 6 h；将获得的重组菌进行12% SDS-PAGE 鉴定。

1. 4 包涵体的粗提取 将诱导的培养物5 039 × g离心15 min；收集菌泥，重悬于50 mL PBS 缓冲溶液（137 mmol ／ L NaCl，1 mmol ／ L KH2PO4，8 mmol ／ L Na2HPO412·H2O，2. 7 mmol ／ L KCl，pH 7. 8）中，置冰上超声裂解，超声总时间30 min（超声功率28%，超声时间5 s，超声间歇时间5 s）；将裂解液5 039×g离心10 min；弃上清，沉淀重悬于PBS 缓冲溶液中，离心洗涤2 次；将包涵体重悬于50 mL 洗涤液缓冲液中（2 mol ／ L 尿素，5 mmol ／ L 磷酸盐，125 mmol ／ L NaCl），超声处理10 min（超声功率28%，超声时间5 s，超声间歇时间 5 s）；5 039 × g 离心 10 min；弃上清，沉淀重悬于洗涤缓冲液中，重复超声2 次，充分洗涤包涵体。

1. 5 包涵体的溶解 将充分洗涤后的包涵体重悬于20 mL 变性溶解液（6 mol ／ L 盐酸胍，20 mmol ／ L 磷酸盐，500 mmol ／ L NaCl，pH 7. 8）中，进一步超声处理以促进包涵体溶解，超声破碎总时间为10 min（超声功率28%，超声时间5 s，超声间歇时间5 s）；将处理后的包涵体悬液于室温振摇过夜，9 380 × g 离心30 min，收集上清。

1. 6 重组蛋白的复性 将8 mL 蛋白变性溶解液用0.45 μm 过滤器过滤后，逐滴加至1 L 复性缓冲液中（50 mmol ／ L NaH2PO4，0. 5 mol ／ L NaCl，0. 1 mol ／ L KCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 7. 8），期间不停搅拌；稀释复性完成后，用0. 45 μm 滤膜过滤复性的蛋白溶解液，收集过滤液。

1. 7 复性蛋白的纯化 用5 倍柱床体积的平衡缓冲液（50 mmol／L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，10 mmol／L 咪唑，pH 7.8）平衡 2 mL Ni-NTA Agarose预装柱；将蛋白溶解液以1. 5 mL ／ min 的速度缓慢过柱；用5 倍柱床体积的洗涤缓冲液（50 mmol ／ L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，20 mmol ／ L咪唑，pH 7. 8）洗涤柱；用洗脱缓冲液（50 mmol ／ L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，250 mmol／ L咪唑，pH 7. 8）将目的蛋白从柱上洗脱下来。

1. 8 纯化产物鉴定 为评价重组蛋白的稳定性，将洗脱产物分装后分别至4 和-20 ℃保存7 d 后，20 238×g 离心5 min，收集上清进行12%SDS-PAGE鉴定。

2 结 果

2. 1 表达产物的鉴定 12% SDS-PAGE 分析显示，表达的目的蛋白在细菌裂解后的沉淀中，相对分子质量约27 000，主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的25%，获得3 g 菌泥。见图1。

图1 IPTG 诱导 6 h 的重组 Hq002 蛋白的 SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE profile of rHq002 expressed after induction with IPTG for 6 h

2. 2 蛋白包涵体粗提后的鉴定 裂解后的细胞碎片经2 次PBS 洗涤后，其中水溶性杂质显著减少，再经2 次2 mol ／ L 尿素溶液超声洗涤后，去掉了大肠埃希菌中大量不溶于水的杂蛋白，包涵体中杂质明显减少。见图2。表明用PBS 缓冲液和2 mol ／ L 尿素重复洗涤包涵体，可去除大量的水溶性杂质和部分水不溶性杂蛋白，达到粗提包涵体的目的。

图2 PBS 缓冲液和2 mol ／ L 尿素洗涤后的蛋白包涵体的SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE profile of inclusion body washed with PBS buffer and 2 mol ／ L urea

2. 3 复性蛋白纯化后的鉴定 逐滴稀释复性后的蛋白溶液可顺利通过0. 45 μm 滤膜，表明重组蛋白在复性过程中未发生聚集。12% SDS-PAGE 分析显示，纯化的蛋白相对分子质量约27 000，与目的蛋白包涵体条带位置相符，见图3。洗脱蛋白时，吸光度达到最高值时收集到1.5 mL 纯化产物，纯化率为19%。

图3 复性蛋白纯化后的SDS-PAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE profile of re-naturalized protein after purification

2. 4 纯化产物的稳定性 纯化产物4 和-20 ℃存放7 d 后，蛋白溶液澄清，未见沉淀产生。12%SDS-PAGE分析显示，存放7 d 后的纯化产物与初纯化产物条带大小相符，见图4。表明纯化产物在4 和-20 ℃可稳定保存，蛋白未出现降解或者聚集。

图4 纯化产物稳定性的SDS-PAGE 鉴定Fig. 4 Identification of stability of purified rHq002 by SDSPAGE

3 讨 论

大肠埃希菌可高效表达外源性真核基因，形成致密且不溶于水的包涵体。包涵体具有正确的氨基酸序列，但氨基酸链折叠时由于大肠埃希菌内环境功能缺陷以致空间结构发生错误折叠，导致蛋白的生物功能丢失及产生聚集。许多真核生物蛋白中含有二硫键，但由于原核细胞蛋白修饰功能的缺失，半胱氨酸可能会在分子间或者分子内形成错误的二硫键，并且也可能形成还原的半胱氨酸残基［2，5］。同时，这些错误的二硫键和残基的形成可能破坏重组蛋白的空间结构，并为蛋白复性为具有天然空间结构和具有生物学活性的重组蛋白带来难度。因此，重组蛋白中是否含有及含有半胱氨酸残基的数量是蛋白复性过程中重要的参考因素，含有多个二硫键的蛋白质则可能需要一个更准确和复杂的复性过程。

重组菌裂解产物经离心后，其沉淀中的主要成分为包涵体，但仍含有许多细胞碎片，这些细胞碎片的主要成分为外膜蛋白、质粒DNA、磷脂等。MIDDELBERG［6］的研究表明，包涵体中存在的杂质可干扰甚至阻碍蛋白的正确折叠，显著降低蛋白复性产率。为了能够尽量去除包涵体中的杂质，可根据这些成分的化学性质选择合适的洗涤剂。添加酶类、洗涤剂、还原剂或低浓度的尿素等可有效去除吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白及膜碎片。超声促进杂质溶解，PBS 缓冲液反复洗涤细胞碎片可去除大部分水溶性杂质，再使用2 mol ／ L 尿素溶液多次洗涤可去除部分水不溶性杂质。本研究用PBS 缓冲液-超声-2 mol ／ L 尿素-超声的方法，去除了大部分的杂质，使包涵体得到初步纯化，为更好地复性提供了参考。

通常使用 6 mol ／ L 盐酸胍或 8 mol ／ L 尿素变性和溶解包涵体，但6 mol ／ L 盐酸胍溶液的变性能力强于8 mol ／ L 尿素溶液。利用高盐离子溶液变性溶解蛋白，使氨基酸链打开，去除盐离子后氨基酸链能够重新折叠，形成有生物活性的重组蛋白。常用的复性方法有稀释，透析和固相色谱法［7］。为了减少氨基酸链的错误折叠，通常会在蛋白复性过程中添加一些小分子添加剂，如低浓度的尿素变性剂、精氨酸、分子表面活性剂PEG、糖类等。含二硫键蛋白复性时，自由巯基和二硫化物之间的相互转化是一个还原氧化过程，因此必须与适当的电子供体和受体联系起来。还原剂可破坏氢键并为伸展状态的肽链创造还原性环境，防止形成非天然二硫键或二硫键的错配。因此，在含多个半胱氨酸残基的蛋白复性过程中会添加一些氧化还原物质，如氧化型 ／ 还原型谷胱甘肽、半胱氨酸 ／ 胱氨酸等［8］。

本研究用6 mol ／ L 盐酸胍溶解包涵体，参考BATISTA 等［9］纯化方法，直接将蛋白溶解液以逐滴滴加的方式加至大体积缓冲液中复性蛋白，获得可溶性的蛋白质。rHq002 含有5 个二硫键，在复性过程中未添加任何添加剂，去除变性剂后蛋白质仍为可溶状态未发生再聚集。提示在大肠埃希菌诱导表达的过程中，重组蛋白可能形成了正确的二级结构，仅仅可能是因为蛋白过量导致分子间发生聚集而形成了包涵体。由于无需形成新的二硫键，蛋白复性时不添加氧化还原物质也可复性成功。因此，包涵体形成的原因也将对蛋白复性的方式以及添加剂的使用产生影响。蛋白复性时，拟复性蛋白始终处于低浓度状态，应给予其充足的时间和空间，促进其正确折叠，避免蛋白分子间的再聚集。本研究结果表明，复性时的蛋白浓度对蛋白复性具有重要影响。如果蛋白浓度（包括目的蛋白和杂质）过高，则复性过程中更易产生蛋白分子间的聚集现象，或者由于复性过程中空间不足导致蛋白的错误折叠，最终将导致复性失败［10］。

多数研究采用先纯化后复性的方式纯化包涵体蛋白，即将包涵体溶解后，在变性条件下亲和层析纯化蛋白，最后经相应方法复性目的蛋白［11-13］。经过纯化可去除蛋白溶液的杂蛋白，而杂质的去除可减少对蛋白复性的干扰，降低复性蛋白质发生聚集的频率。本研究前期采用了先纯化后复性的方式，但在复性过程中重组蛋白析出，无法成功复性。受到BATISTA 等［9］研究的启发，我们采用先复性后纯化的方式，成功获得可溶性并稳定存在的目的蛋白。去除变性剂后的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化浓缩后获得高纯度可溶性重组蛋白。结果表明，该重组蛋白需要在低浓度及温和条件下才可复性，与其他蛋白的纯化复性方式存在差异，这种现象可能与重组蛋白的特性有关。蛋白是否复性成功，可溶性是最基本的判断方法，并不能完全证实其恢复蛋白质的天然状态。除非进行一系列功能性实验验证，或者是获得蛋白质的晶体结构。

蛋白质复性过程的影响因素很多，从包涵体的洗涤、蛋白的变性溶解、蛋白的复性到蛋白纯化等一系列过程，均直接或间接影响蛋白复性，蛋白的理化学性质可作为蛋白复性条件的参考［14］。此外，重组蛋白在大肠埃希菌中诱导形成包涵体的过程以及包涵体的形成方式同样也是不能忽略的复性参考因素。重组蛋白的复性是复杂而繁琐的过程，涉及许多物理和化学条件，如氧化还原剂浓度、温度、pH值、盐离子浓度、时间等因素。蛋白复性纯化没有固定的方式，由于蛋白性质的不同，其纯化复性方式也不相同。应根据不同重组蛋白的性质及其包涵体的特性进行溶液体系的配制及复性纯化方法的筛选［15］，以达到最大复性产率。