基于转录组数据高通量发掘灰茶尺蠖微卫星标记

王定锋，李良德，李慧玲，李金玉，吴光远

(福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福州 350013)

简单重复序列(Simple Sequence Repeats, SSR)分子标记，又称为微卫星(Microsatellite)、短串联重复(Short Tandom Repeats)或简单序列长度多态性(Simple Sequence Length Polymorphism)，是指生物体中以少数几个核苷酸(通常为1～6个)为单位的多次串联重复的DNA序列，其具有共显性、多态性丰富、数量多且分布均匀、易检测和无放射性等优点[1-2]，已成为当前最流行的分子遗传标记之一。微卫星标记已被广泛运用于昆虫种群遗传结构、昆虫生态习性和定位昆虫特定基因等的研究中[3]。Kim等[4]用7个多态性SSR位点分析了来自美国9个州10个地区的595个玉米根虫个体来研究其种群的遗传结构。结果表明，所有种群表现出高度的遗传多样性，等位基因多样性从7.3到8.6，期望的杂合度从0.600到0.670。采用SSR分子标记技术对平泉县5个油松毛虫亚居群进行遗传多样性和遗传分化研究，结果表明天然油松纯林居群内杂合度要比其他居群高，且亚居群间已发生明显的遗传分化[5]。Trontti等[6]用SSR标记分析了一夫多妻的蚂蚁(Plagiolepis pygmaea)3个种群的交配、扩散模式和血缘关系。Zheng等[7]在冈比亚按蚊染色体上发现了3个与吞噬疟原虫有关的数量性状位点(QTL)，其中一个为主效QTL，另两个为微效的QTL。

灰茶尺蠖Ectropisgrisescens，又称灰茶尺蛾，属鳞翅目尺蛾科，是一种重要的茶树害虫，在我国主要产茶区均有分布。其以幼虫咬食茶树叶片为害，爆发成灾时能在短时间内快速吃光整片茶园嫩叶、嫩茎和老叶，严重影响树势和茶叶的产量。寄主有茶、油茶等[8]。该虫地理分布广，利用SSR标记来研究其不同地理种群遗传多样性情况具有重要的意义。尽管如此，当前还未见从灰茶尺蠖开发出微卫星标记的报道。随着新一代高通量测序技术的飞速发展和测序成本的大幅下降，越来越多物种的转录组数据被测序出来，利用转录组数据开发相应的SSR标记的方法也越来越成熟。罗梅等利用转录组数据从扶桑绵粉蚧28120条unigenes中初步发掘出1228对微卫星引物[9]。陈小红等[10]以6份不同地理来源的糜子资源为材料，从糜子转录组数据库中开发了一批(80对)多态性好的SSR引物。黎东海等[11]从齿缘刺猎蝽转录组数据中筛选的2395个微卫星位点中随机选取的54对引物对9个不同地理种群进行分析，结果表明，有16对引物能较好地扩增出目的片段。冷春蒙等[12]用MISH软件从梨小食心虫幼虫中肠转录组数据中发现12690个SSR位点。本研究通过对灰茶尺蠖转录组中SSR位点进行统计分析，首次明确灰茶尺蠖SSR位点组成、分布和特征，大规模发掘出的SSR标记，将为灰茶尺蠖种群生态学的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试虫RNA提取及转录组测序

灰茶尺蠖采自福建省福安市社口镇福建省农业科学院茶叶研究所试验茶园(作为第1代)，于24±1℃，RH 75%，12L∶12D条件下采集新鲜茶梢室内供养。将第2代茶尺蠖的卵进行收集、分离，使第2代室内供养昆虫在卵期保持同步。试验设置5个处理，处理1(卵块)、处理2(1、2和3龄幼虫混合样，每个龄期5头)、处理3(4和5龄幼虫混合样，每个龄期5头)、处理4(蛹，雌雄各5头)和处理5(成虫，雌雄各5头)，每个处理2次重复。取样后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2 RNA提取及转录组测序

利用EastepTMTotal RNA Extraction Kit(Promega公司)提取总RNA，RNA样品检测由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成，利用1%琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop超微量分光光度计和安捷伦2100生物分析仪，分别检测RNA的降解程度及是否有污染情况、检测RNA 的纯度、浓度和完整性。结果符合建库后委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行cDNA文库构建以及Illumina HiSeq 4000测序。

1.3 SSR位点鉴定

采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html，默认参数)对获得的灰茶尺蠖转录组数据库进行SSR检测。

2 结果与分析

2.1 灰茶尺蠖总RNA质量的检测

总RNA电泳图中可以看出28S和18S条带完整清晰，表明获得的RNA质量良好，未发生降解和污染(图1)。RNA 的纯度、浓度以及RNA的完整性检测结果显示，OD260/OD280为2.06～2.17，OD260/OD230为1.84～2.27，RNA完整性为7.80～9.40(表1)。以上结果表明，获得的总RNA符合建库要求。

图1 灰茶尺蠖总RNA的琼脂糖电泳检测图Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA in E. grisescens注：M:Trans 2K Plus；1-10分别为样品卵-1、卵-2、幼虫小-1、幼虫小-2、幼虫大-1、幼虫大-2、蛹-1、蛹-2、成虫-1和成虫-2。

表1 灰茶尺蠖总RNA质量检测结果

2.2 灰茶尺蠖转录组中SSR的数量

对灰茶尺蠖转录组测序denovo组装，总共获得66468条unigenes，N50为2143bp，注释出37483个基因，转录组数据未发表。利用MISA软件对灰茶尺蠖转录组66468条unigenes的进行检索，检测碱基85225911bp，共找到18339个SSR位点，出现频率(出现频率=SSR数目/总unigenes数目×100%；)为27.59%，平均每4.65 kb有一个SSR位点。18339个SSR位点分布在13465条unigenes中，分布频率(发生频率=含有SSR的unigenes数目/总unigenes数目×100%)为20.26%；其中，3217条unigene包含有1个以上SSR位点，1188条unigene具有复合型SSR。

2.3 SSR基元分布特点

灰茶尺蠖转录组SSR重复类型丰富，包含1～6种核苷酸重复类型；出现频率大小依次是单核苷酸(68.14%)>二核苷酸(16.25%)>三核苷酸(13.40%)>四核苷酸(1.82%)>五核苷酸(0.23%)>六核苷酸(0.14%)(表2)。灰茶尺蠖转录组中18339个SSR位点中共发现84种重复基元。在单核苷酸重复里包含A/T和C/G两种类型，其中A/T为主要类型，占了总量的65.47%。二核苷酸重复里包含AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG 4种类型，其中AT/AT为主要类型，占了总量的4.86%。三核苷酸重复里包含AAC/GTT、AAG/CTT和AAT/ATT等10种类型，其中CCG/CGG为主要类型，占了总量的3.44%。四核苷酸重复里包含AAAC/GTTT、AAAG/CTTT和AAAT/ATTT等24种类型，其中ACAG/CTGT为主要类型，占了总量的0.68%。五核苷酸重复里包含AAAAC/GTTTT、AAAAT/ATTTT和AAACG/CGTTT等23种类型，其中AAATG/ATTTC为主要类型，占了总量的0.04%。六核苷酸重复里包含AAAAAC/GTTTTT、AAAAAT/ATTTTT和 AACGCC/CGTTGG等21种类型，其中CCCGCG/CGCGGG为主要类型，占了总量的0.02%(表3)。灰茶尺蠖转录组SSR重复单元的重复次数分布在5～91次之间。其中5～9次重复的有5236个SSRs，占28.55%；10～14次重复的有11659个SSRs，占63.57%；15及以上次重复的有1444个SSRs，占7.87%(图2)。

表2 基于重复单元数目中SSRs在灰茶尺蠖转录组中的出现频率

图2 SSRs重复次数分布Fig.2 Distribution of numbers of repeated SSRs

表3 基于基序类型中SSRs在灰茶尺蠖转录组中的出现频率

(接表3)

(接表3)

3 讨论与结论

大量研究表明，不同物种中SSR出现频率与物种特异性、数据库大小和SSR搜索标准等存在较大关系[13-15]。本研究从灰茶尺蠖中共找到18339个SSR位点，出现频率为27.59%。SSR出现频率与星天牛(25.31%)[14]相当，低于大垫尖翅(44.17%)[16]，但远高于东方粘虫(11.50%)[15]、荔枝蒂蛀虫(15.25%)[17]、黑翅土白蚁(9.98%)[18]、扶桑绵粉蚧(6.33%)[9]、烟粉虱(5.07%)[19]和橘小实蝇(4.23%)[20]。

前人研究表明，存在大量短重复基序的物种具有相对较高进化水平[21]，而长重复基序占优势的物种往往突变频率较低或进化时间较短[22]。本研究结果表明，灰茶尺蠖转录组中SSR重复类型丰富，其中最主要重复类型是单核苷酸重复(68.14%)，这与东方粘虫[15]、扶桑绵粉蚧[9]等研究结果一致；但不同于橘小实蝇[20]、褐飞虱[23]和二点委夜蛾[24]等昆虫中SSR主要的重复类型是三核苷酸重复。灰茶尺蠖转录组中短重复基序(单核苷酸重复占68.14%，二核苷酸16.25%，三核苷酸13.4%)占绝对优势，表明其处于较高的生物分类阶层中，具有较高的进化水平。

在灰茶尺蠖转录组中挖掘SSR标记发现单碱基重复基元中，优势重复基元为A/T(65.47%)，远远超过其它重复类型。该结果与其它多种昆虫如扶桑绵粉蚧[9]、印度谷螟[27]和褐飞虱[28]等的研究结果相似；这一现象也符合前人研究发现，多数物种的SSR重复基序中A/T发生较普遍，而G/C一般频率低。这可能与打破A/T的2个氢键较打破G/C的3个氢键容易有关[25-26]。