人诱导性多能干细胞分化的血管平滑肌细胞体外培养圆环形工程化组织的实验研究△

周嘉辉，马文韬，姚博谦，罗 玮，方丽君，刘 鹏，林展翼，

［1.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；2.广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；3.华南理工大学医学院，广州 510006；4.广东省东莞市松山湖中心医院，广东东莞 523326；5.南方医科大学南方医院，广州 510515；6.华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006］

组织工程无支架培养如细胞薄片技术（cell sheet）是组织工程培养常用的方法之一，它通过种子细胞分泌细胞外基质自组装（self-assembly）的方式形成特定结构和功能的工程化组织，目前被广泛应用于器官补片、皮肤、角膜及心血管移植材料的构建，部份产品已进入临床研究［1］。过去种子细胞以人体或大动物分化成熟的细胞为主，人源性细胞产生的细胞外基质与人体接近，是组织工程培养比较理想的细胞来源。但成熟的人体细胞来源有限，个体差异大，无法满足开展大规模组织工程培养的需求。随着干细胞技术的发展，人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）可为组织工程培养提供充足的的人源性种子细胞［2-3］。人iPSC 的分化受诸多因素影响，不同批次诱导分化的种子细胞存在不均一性［4-5］，而种子细胞的性状，如增殖和分泌细胞外基质的能力，直接影响组织工程培养物的质量［6］。因此，建立一种快速有效的实验方法，在组织工程培养前对iPSC 来源的种子细胞进行质量评价，对获得优质的组织工程产品有重要的指导价值。本研究利用人iPSC 分化的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）在体外培养圆环形工程化组织，通过对组织的形态、结构及细胞外基质的观察分析，建立一种评价人iPSC 来源的种子细胞应用于组织工程培养的实验方法。

1 材料和方法

1.1 诱导人诱导性多能干细胞分化血管平滑肌细胞的方法

诱导人iPSC分化VSMC的方法参照本课题组先前发表的文献［7］。人iPSC（购自Cellapy）用MTeSR（STEMCELL）培养基在Matrigel 包被的6 孔板上培养，每天换液至克隆团生长融合到80%左右，用1 U/mL 的中性蛋白酶在37°C 二氧化碳培养箱中消化10 min，吸去中性蛋白酶后重新加入MTeSR 培养基，用吸管吹打iPSC 克隆团使它变成均匀的小团块，转移至低吸附6 孔板（Corning）悬浮培养诱导拟胚体，第2 天开始以MTeSR 和EB 培养基混合培养，并逐渐增加EB 培养基的比例。EB 培养基由高糖DMEM（Corning）、10%胎牛血清（Corning）、1%非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、0.012 mmol/L巯基乙醇组成。第5 天收集拟胚体放入明胶包被的6 孔板，加入EB 培养基贴壁培养5 d，然后用0.25%胰蛋白酶消化，再把细胞放入Matrigel 包被的T75 培养皿，用含1 ng/mL 转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β1）（PEPROT⁃ECH）的SmGM-2 培养基（Lonza）贴壁培养7 d，隔天换液，培养结束后对细胞进行a-SMA，Cal⁃ponin，MYH-11 及SM-22 平滑肌细胞特异性标志物免疫荧光染色。

1.2 琼脂基质模型的制作和圆环形组织培养

按图1A 所示用树脂以3D 打印方法制作圆环形琼脂培养基质的模具，环氧乙烷消毒备用。按2%浓度称取琼脂粉（索莱宝）加入DMEM 培养基，经高温高压蒸气溶解并灭菌，趁热在超净工作台内倒入经消毒的模具，自然冷却得到琼脂培养基质（图1B）。取出琼脂培养基质放入12 孔培养板内，向琼脂培养基质内加入2×106人iPSC 诱导的VSMC细胞悬液，在琼脂培养基质与培养板的间隙加入少量DMEM 培养基保持培养板内的湿度，放入37 °C 二氧化碳培养箱静置24 h，然后吸掉培养板内的DMEM 培养基，轻柔地加入成环培养基，使培养基淹没琼脂培养基质并浸润VSMC。成环培养由含20%胎牛血清、10 ng/mL PDGF（PEPROTECH）、1 ng/mL TGF-β、50 μg/mL 脯氨酸、50 μg/mL 甘氨酸、20 μg/mL 丙氨酸、3 ng/mL 硫酸铜和100 μg/mL维生素C 的高糖DMEM 培养基组成。此后每2 d换液1 次，7 d 后收获圆环形组织。

图1 iPSC-VSMC 培养的圆环形组织（A：琼脂培养基质模具图样；B：琼脂培养基质实物；C：iPSC-VSMC 在琼脂培养基质中生长成圆环；D：圆环组织外观；E：圆环组织抵受镊子张力；F：圆环组织串于小管上）

1.3 圆环形组织的形态学检测

对培养获得的圆环形组织进行大体观察并拍照，OCT 液包埋冷冻后切片，分别行苏木素伊红（HE）染色，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白（PEPROTECH）染色及a-SMA、Calponin、MYH-11、SM-22a（Ab⁃cam）细胞免疫组化染色。

2 结果

以EB 法诱导人iPSC 分化的VSMC 形态与原代培养的细胞类似，为长梭形，免疫荧光染色表达a-SMA，Calponin，MYH-11 及SM-22a 等VSMC 特异性标志物（图2）。把诱导分化的VSMC 置于琼脂基质中培养7 d 获得圆环形工程化组织，该组织形态规整，具有一定的力学强度，能自我维持组织形态（图1C～F）；内部含有以胶原蛋白为主的细胞外基质（图3B～D），基质间细胞排列紧密，持续表达成熟的VSMC 标志物（图3E～H）。

图2 EB 法诱导人iPSC 分化VSMC 及免疫荧光染色荧光显微镜下图像（×100；A：Matrigel 上培养的iPSC；B：悬浮培养的拟胚体；C：iPSC-VSMC 贴壁培养第1 天；D：iPSC-VSMC 贴壁培养第12 天展现平滑肌细胞形态；E：a-SMA 免疫荧光；F：Calponin 免疫荧光；G：MYH-11 免疫荧光；H：SM-22 免疫荧光）

图3 圆环组织切片染色光学显微镜下图像（标尺：200 μm；A：苏木素伊红染色；B：Ⅰ型胶原蛋白染色；C：Ⅲ型胶原蛋白染色；D：Ⅳ型胶原蛋白染色；E：a-SMA免疫组化染色；F：Calponin 免疫组化染色；G：MYH-11免疫组化染色；H：SM-22免疫组化染色）

3 讨论

组织工程培养的目的是为人体受损的组织器官提供替换和修复的材料。为减轻移植后的炎症反应，组织工程培养应尽量采用人体细胞，减少合成材料的应用［8］。组织工程无支架培养从这个理念出发，通过细胞薄片技术目前已开发出一系列组织工程产品并应用于临床试验。人源性种子细胞应用于组织工程培养，分泌与体内天然成份接近的细胞外基质，具有其他种属种子细胞无法比拟的优点，但随着产业化的发展，分化成熟的人体细胞将无法满足大规模培养的需求。

人iPSC 有向三胚层细胞分化的能力，是人源性种子细胞的一个重要来源，目前已有许多公开发表的诱导分化方案［9-12］。人iPSC 的分化受诸多因素影响，不同批次诱导分化的种子细胞存在不均一性。种子细胞的质量直接关系到组织工程产品的质量。因此，建立一种快速有效的实验方法，在组织工程培养前对iPSC 来源的种子细胞进行质量评价，对获得优质的组织工程产品有重要的指导价值。

本研究通过前期的研究，已建立稳定高效的诱导人iPSC 分化为VSMC 的方法。后者作为种子细胞加入到琼脂培养基质培养7 d，即可获得一块结构完整的圆环形工程化组织，组织切片显示组织内部含有以胶原蛋白为主的细胞外基质，基质间细胞排列紧密，提示人iPSC 分化的VSMC 具有良好的增殖和分泌能力，种子细胞所分泌的细胞外基质通过自组装形式形成圆环形三维组织，初步验证了种子细胞符合组织工程培养要求。本研究建立的体外培养及组织评价的方法，是一种快速有效的评价人iPSC 来源的种子细胞应用于组织工程培养的实验方法。

综上所述，诱导人iPSC 分化VSMC 可获取大量种子细胞，利用该细胞可成功培养出结构完整的圆环形工程化组织。对组织的形态、结构及细胞外基质的观察分析可作为评价人iPSC 来源的种子细胞应用于组织工程培养的方法。

本研究存在一些不足之处，如培养时间较短，未在机械应力加载条件下摸索种子细胞的生长规律等，在未来的实验研究中将会进一步完善。