葛根芩连汤对KKAy 糖尿病小鼠肠道菌群结构的影响

王 芬，吴丽丽，焦婷婷，何华亮

（1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学，北京 100029；3.武警北京总队医院，北京 100027）

葛根芩连汤出自《伤寒杂病论》太阳病篇，是治疗湿热证的急性腹泻的经典代表方剂。方中由葛根、黄芩、黄连、甘草4 味药组成。原文记载“太阳病，桂枝证医反下之，利遂不止。脉促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黄连黄芩汤主之”。主治太阳病邪热内传、大肠传导失司所致的下利。制方之理在于太阳表邪未解，邪陷阳明，大肠湿热壅滞，里热蒸肺迫肠，升降失调，津液外泄。近年来，经过临床反复验证该方具有一定的治疗糖尿病作用[1-2]，结合临床疗效及现代药理[3]，对于 2 型糖尿病发病初期，因饮食不节致肺胃实热证或湿热内蕴体质的患者，该方能够明显改善临床症状、降低血糖水平。按《伤寒论》原文意旨，存在肠道湿热壅滞、出现利遂不止症状，正好契合现代医学理论——肠道菌群结构变化这一机制。故本研究立足中西互参，在共同病位及主证的基础上，通过观察葛根芩连汤对2 型糖尿病小鼠肠道菌群结构的影响以期揭示其部分降糖机理，丰富中医临床与实验研究相互佐证的证据，为糖尿病防治提供新思路、新视角。

1 材料

SPF 级雄性 KKAy 小鼠65 只及C57BL 小鼠13只，均购自北京华阜康生物科技有限股份公司，[许可证号：SCXK（京）2014-0004]，10 周龄，体质量（35.5±3.0）g。大鼠在无特定病原体（SPF 级）条件下饲养，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心。饲养条件：温度（21±2）℃，湿度（60±10）%，12 h/12 h 光照黑暗循环。该实验已通过中国中医科学院中医基础理论研究所[许可证号 SYXK（京）2016-0021]动物实验伦理会审查（编号2019-067），符合实验动物伦理委员会相关指导原则。HiPure 土壤 DNA 试剂盒（或 HiPure 粪便 DNA 试剂盒）Magen，Guangzhou，China）according。葛根芩连汤配方颗粒由广东一方制药厂制备，由葛根、黄芩、黄连、甘草按照 8 :3 :3 :2 的比例组方。实验前用蒸馏水配制，超声30 min 后4 ℃保存。Agilent 2100 生物分析 仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。

Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA）。Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）仪器。3K15 型高速低温离心机（美国Sigma 公司），HiSeq 2500 型高通量测序仪（美国Illumina 公司），Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）仪器，T 100型梯度 PCR 仪（美国Bio-Rad 公司），DL-CJ-2NDI 型超净工作台（中国东联哈尔仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 分组 小鼠适应性喂养1 周后，设雄性 C57BL小鼠为正常组，予普通饲料喂养；雄性 KKAy 小鼠给予华阜康公司生产的高脂饲料喂养2 周，随机平均血糖≥13.9 mmol/L，为成模小鼠，共44 只。按体质量及随机血糖随机分为5 组，正常组、阳性组（3.9 mg/kg）、葛根芩连汤高、低剂量组（18.2、4.55 g/kg）及模型组（生理盐水20 mL/kg），每组11 只。给药组均按 0.01 mL/g·d 的标准灌胃给药1 次，正常组和模型组则予相同剂量的生理盐水灌胃1 次，连续8 周。喂养过程中小鼠均自由取食、饮水。

2.2 取材及指标检测 喂养过程中，每周监测血糖及体质量。第8 周，末次给药后禁食不禁水10 h，予眶静脉取血，分离血清备用。取小鼠新鲜粪便，-80 ℃ 保存。

2.3 肠道菌群DNA 提取，PCR 扩增及建库 将粪便放至离心管中研磨，加入裂解液，混匀后加入Proteinase K 及溶菌酶，颠倒混匀，55 ℃孵育箱中孵育2 h 后，12 000 r/min 离心5 min，吸取上清，加入蛋白沉淀液，涡旋 10 s 后置冰上5 min，再次离心，抽取上清，加入异丙醇，混匀后冰上放置20 min。离心后倒出液体，沉淀物用 75% 乙醇1 mL 反复洗涤 2 次，离心，弃上清，白色沉淀适度干燥，加入双蒸水50 μL，震荡后加入 RNase A 1 μL，颠倒混匀后37 ℃ 温育15 min。以稀释后的基因组 DNA 为模板。

以30～50 ng DNA 为模板，使用设计的一系列 PCR 引物扩增原核生物 16S rDNA 上包括 V3及 V4 的 2 个高度可变区。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“ GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”序列的下游引物扩增 V3 和 V4 区。另外，通过PCR 向16S rDNA 的PCR 产物末端加上带有 Index 的接头，以便进行NGS 测序。使用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）检测文库质量，并且通过 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA）检测文库浓度。DNA 文库混合后，按 Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）仪器使用说明书进行PE 250/300 双端测序，由MiSeq 自带的MiSeq Control Software（MCS）读取序列信息。

2.4 肠道菌群数据分析 双端测序得到的正反向 reads首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N 的列，保留序列长度大于200 bp 的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于OTU 分析，使用VSEARCH（1.9.6）进行序列聚类（序列相似性设为 97%），比对的16S rRNA 参考数据库是 Silva 132。然后用RDP classifier（Ribosomal Database Program）贝叶斯算法对OTU 的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU 的分析结果，采用对样本序列进行随机抽样的方法，分别计算 Shannon、Chao1 等α 多样性指数，并作出稀释曲线。通过 unweighted unifrac 分析比较样本间是否有显著的微生物群落差异，基于Brary -Curtis 样本间距离矩阵用于 PCoA（principal coordinates analysis）可视化图展示β 多样性。通过层次聚类（Hierarchical cluatering）中的非加权组平均法构建UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）进化树。

2.5 统计学方法 采用 SPSS 22.0 统计软件，各组数据以均数±标准差（）表示；组间比较用单因素方差分析，2 组间数据比较通过 T-test 或 Wilcox 秩和检验或 Tukey 检验，用于分析组间物种多样性差异是否显著。

3 结果

3.1 葛根芩连汤对 KKAy小鼠体质量的影响 见表1。

表1 治疗前后 KKAy 小鼠体质量比较（，n =10）g

表1 治疗前后 KKAy 小鼠体质量比较（，n =10）g

注：与正常组比较，## P ＜0.01，与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.2 葛根芩连汤对KKAy 小鼠血糖的影响 见表2。

表2 治疗前后 KKAy 小鼠血糖比较（，n =10）mmol/L

表2 治疗前后 KKAy 小鼠血糖比较（，n =10）mmol/L

注：与正常组比较，## P ＜0.01，与模型组比较，△△P ＜0.01，与阳性组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

3.3 葛根芩连汤对KKAy 小鼠肠道菌群16s rRNA 的影响 送检50 个小鼠粪便样本中。通过检测16s rRNA V3，V4 区，总共获得片段14 756 448 个，经过裁剪与修饰后获得7 378 224 个。其中，正常组小鼠片段954 115 个，占总量的12.93%；模型组片段960 062 个，占总量的13.01%；阳性组有1 058 427 片段，占总量的14.35%；葛根芩连汤高剂量组有732 209 片段，占总量的9.92%；葛根芩连汤低剂量组有1 042 801 片段，占总量的14.13%；小鼠片段从47 425 个到64 808 个，平均为56 416 个，平均长度为454 bp。

3.3.1 KKAy 小鼠肠道菌群操作分类单元（OTU）分析 OTU 数量表示小鼠肠道内容物中微生物的丰度，数值越大表明微生物越丰富。通常以细菌群落丰度指数与群落多样性指数来衡量，群落丰度指数包括Chao1 和ACE，此指数值越大说明群落的丰度越高。与正常对照组相比，模型组小鼠OTU 数量显著下降。使用葛根芩连汤后小鼠菌群多样性与模型比较出现了显著的差异，且菌群多样性均高于阳性对照。在菌群多样性方面，葛根芩连汤组与正常组无显著性差异，说明葛根芩连汤对糖尿病小鼠菌群有明显的改善。其中不同浓度的葛根芩连汤组对OTU 数量影响不同。低剂量组有着相对较好改善菌群的效果。见表3、图1。

表3 葛根芩连汤对KKAy 小鼠肠道菌群物种的丰度比较（，n =10）

表3 葛根芩连汤对KKAy 小鼠肠道菌群物种的丰度比较（，n =10）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05

图1 OTU 分析结果

3.3.2 葛根芩连汤对群落多样性指数的影响 见表4。

表4 葛根芩连汤对KKAy 小鼠菌群多样性及均度影响（，n =10）

表4 葛根芩连汤对KKAy 小鼠菌群多样性及均度影响（，n =10）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3.3 菌群的群落结构 对各组中每个样本在门的水平上整体的群落结构差异并不大，所有样品均包含Firmicutes（厚壁菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）2 个主要的门，同时还包含Proteobacteria（变形菌门）、Patescibacteria 和Actinobacteria（放线菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）。

3.3.3.1 纲结果 正常组中以Bacteroidia、Clostridia为主。不同浓度的葛根芩连汤给药组对于菌群影响较大，高剂量组大大提升了Bacteroidia 的丰度，占比66.20%。而低剂量组只有41.61%，同时也降低了Bacilli、Clostridia（P＜0.05）丰度。葛根芩连汤组能显著降低Bacilli 和Saccharimonadia 丰度和占比，使其更加接近于正常组，结合α 多样性分析，可见葛根芩连汤组对恢复菌群丰度及多样性有一定疗效。模型组中几乎消失的Verrucomicrobiae，在葛根芩连汤低剂量组中显著提高，占比可达到2.23%，这是其他治疗组中所没有的。

3.3.3.2 属结果 给药后，模型组中Lactobacillus（P＜0.001）、Bacteroides（P＜0.01）、Alistipes（P＜0.01）、Streptococcus（P＜0.05）丰度显著上升，组内占比分别达到34.97%、10.41%、6.71%和2.38%。而Akkermansia（P＜0.001）、Allobaculum（P＜0.001）丰度显著下降，模型组丰度几乎为0。f__Muribaculaceae_Unclassified、Lachnospiraceae_NK4A136_group 丰度虽然下降，但并不显著。阳性组治疗后，Bacteroides（P＜0.05）丰度显著下降，占比降低为3.77%。f__Muribaculaceae_Unclassified、Lachnosp-iraceae_NK4A136_group 和Alistipes 的 丰度虽然在一定程度的略有降低，但无显著性差异。Akkermansia 丰度却显著性上升，说明阳性组主要通过调节Bacteroides 和Akkermansia 丰度来恢复菌群稳态。

中药组中，Bacteroides（P＜0.05）和Alistipes（P＜0.01）在葛根芩连汤低剂量组显著降低，而Akkermansia（P＜0.05）丰度显著升高。中药组相较于模型组，Lactobacillus（P＜0.05）丰度显著降低，其中低剂量组中占比降为15 %。而f__Muribaculaceae_Unclassified（P＜0.05）和Ruminococcaceae_UCG-0144 显著上升，且f__Muribaculaceae_Unclassified 在高剂量组与正常组中无明显差异。中药组相较于阳性组，Lactobacillus 丰度下降，Akkermansia 和f__Muribaculaceae_Unclassified丰度占比上升，可以说明葛根芩连汤组主要通过影响菌 群Lactobacillus、Akkermansia 和f__Muribaculaceae_Unclassified 丰度来调整菌群结构，其中低剂量组菌群结构与正常组最接近。见图2。

图2 属水平物种相对丰度图

3.3.3.3 科水平 在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。差异物种Biomarker 跟随组进行着色，红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群。英文字母表示物种名称。LDA 值分布柱状图中展示了LDA Score ＞设定值（默认设置为2）的物种，即组间有统计学差异的Biomarker。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小（即为LDA Score）。见图3。

图3 进化分支图

3.3.4 菌群分类 模型组主要以乳杆菌纲水平下的_Lactobacillus 乳酸菌为优势菌。葛根芩连汤低剂量组以梭菌目下Lachnospiraceae 毛螺菌科以及Verrucomicrobiales 疣微菌目水平下Akkermansiaceae 为优势菌。葛根芩连汤高剂量组优势菌种有Bacteroidales 拟杆菌目下普雷沃氏菌科和Proteobacteria 变形菌门下Enterobacteriales 肠杆菌目Enterobacteriaceae 肠杆菌科。见图4。

图4 LDA Score

3.3.5 小鼠肠道菌群主成分分析（principal component analysis，PCA）图5 可以看出，各组分有着明显分离，正常组与其他组明显分离，说明菌群有着明显的差异，除正常组和阳性组，其余组与模型组有部分重叠或者距离相近。对比给药组，模型组经过用药处理后，葛根芩连汤组中，葛根芩连汤高剂量组和模型组菌群较为相似，葛根芩连汤低剂量组与模型组有显著性差异，且该组内样本的菌群差异较其他组增大。

图5 菌群主成分分析

4 讨论

2 型糖尿病已经成为全球面临的严重的公共卫生问题。近年来，据统计全球糖尿病的医疗成本至少是人均医疗保健支出的3.2 倍，糖尿病并发症的医疗成本上升到9.4 倍[4]。而作为与2 型糖尿病发病主要相关的超重和肥胖的增长，已成为代谢性疾病未来趋势的更可怕的预测的代表[5-6]。随着糖尿病作用机理研究的不断深入，肠道菌群已成为近年来研究的新兴热点。已证实，肠道菌群是有效调控血糖的代谢途径之一[7-9]。诸多研究表明，中医药通过调节肠道菌群能够抑制胰岛素抵抗和2 型糖尿病炎症反应[10]。现已证明，肠道菌群失衡是糖代谢异常的始动因素。肠道菌群紊乱，可以引起慢性炎性反应，引起胰岛素抵抗，进而诱发2 型糖尿病的发生[11-12]。其中肠屏障功能破坏是引起代谢性内毒素血症的重要环节，[13]。葛根芩连汤具有明确治疗2 型糖尿病肺胃实热证及胃肠实热证的临床疗效，故本研究立足于此探索其具体作用机理。

实验结果表明，与正常组相比，糖尿病模型组小鼠肠道内菌群从门水平到属水平均发生了变化。肠道菌群中拟杆菌门和厚壁菌门的丰度与糖尿病的发生密切相关，它们主要参与了肠道内糖、脂的代谢等过程。本研究中，模型组及阳性组小鼠肠道菌群中厚壁菌门丰度有不同程度上升，其中模型组厚壁菌门升高源于糖尿病菌群失调，阳性组增多原因考虑可能是产丁酸盐菌数量增多，例如Ruminococcus，从而达到对机体保护的作用。同时也提示，阳性药物阿卡波糖与中药葛根芩连汤发挥调节作用的菌群是有一定区别的。这与贾强等研究结果相一致[14]。Ley 等分析大鼠及人群的肠道菌群基因序列发现，瘦鼠的拟杆菌门数量比胖鼠多 50%，厚壁菌门的数量则低于胖鼠。肥胖人群肠道内的厚壁菌门比例高于正常人群，减肥成功后，其肠道内的厚壁菌门比例会大幅下降[15]。揭示厚壁菌门与肥胖明显相关。本研究动物模型为自发性2 型糖尿病模型，予高脂饲料喂养，提示其糖、脂代谢异常均参与了肠道菌群结构的改变。另外，与正常对照组相比，糖尿病小鼠的 Shannon 指数显著下降，而药物治疗组则抑制了这种趋势，其中葛根芩连汤低剂量组的OTU、ACE、chao1 与正常组并无显著差异，提示该组在调节菌群多样性方面效果显著。

乳酸杆菌的比例升高，可以增加胰岛素分泌，阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制内毒素的产生，从而维持肠道的微生态平衡。因此，增加乳酸杆菌比例被认为是对 2 型糖尿病患者具有降低血糖的保护作用。研究结果显示，模型组小鼠肠道中乳酸杆菌 丰度升高，分析可能与其抵御 2 型糖尿病小鼠体内炎症因子有关，此结果与吴莉娟研究的结果相一致[16]。给予葛根芩连汤干预后，肠道中乳酸杆菌丰度下降，给药组乳酸杆菌丰度接近于正常组，说明葛根芩连汤具有一定程度缓解低度炎症的效果，或者具有一定程度的类似于乳酸杆菌对机体的调节作用。Akkermansia 的有效性主要源于其对肠炎症如肠炎或慢性肠易激综合征的抑制作用，现研究已明确 Akkermansia 可减少对肥胖症和糖尿病的影响。葛根芩连汤低剂量组能够提高Akkermansia 的丰度，说明中药可能通过改善肠道炎性反应、调节脂代谢起到缓解 2 型糖尿病及胰岛素抵抗的作用。本研究结果显示，葛根芩连汤低剂量组对肠道菌群结构的改善优于高剂量组。

糖尿病患者的肠道菌群结构变化与肠道非特异性炎症有明显相关性[18]。已证实，大量革兰氏阴性菌死亡溶解后，释放的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用于细胞表面 Toll 样受体 4（TLR4），引发一系列炎症因子，产生机体的低度炎症状态[19]，从而产生胰岛素抵抗，并破坏胰岛β细胞功能，导致 2型糖尿病[20]。故应进一步加强该方面的研究。