瑞舒伐他汀强化治疗对心肌梗死PCI术后小鼠心肌线粒体稳态的影响

孟红社

心肌梗死为临床常见疾病，若不及时予以干预，可能引起病人心室壁收缩出现异常的现象，导致心脏收缩力异常下降，造成泵血功能异常，进一步导致心室整体结构异常，最终演变为心力衰竭，严重威胁病人的生命安全。近几年，由于介入技术的进展，使得经皮冠状动脉介入术(PCI)成为心肌梗死病人的主要治疗方式，虽然其能够使坏死心肌组织恢复血流灌注，缩小心肌梗死面积，但是也存在一定的局限性，并不能有效改善心肌收缩力及心室重构[1]。心肌梗死疾病的发病机制中心室重构发挥重要的作用。线粒体在细胞中时刻进行动态重构过程，主要有线粒体生物合成、线粒体自噬、线粒体融合/分裂等，与线粒体稳态发挥协同作用，进一步调控线粒体内三磷酸腺苷(ATP)以及活性氧的输出[2]。有研究表明，心肌细胞线粒体稳态出现障碍以后，能够引起机体内能量供应出现异常，与此同时引起机体氧化应激损伤，并且能量供应异常及氧化应激损伤均是心室重构的关键病理因素[3]。瑞舒伐他汀具有调脂、抗炎等作用[4]。但是有研究预测瑞舒伐他汀也可改善心肌线粒体稳态，此方面的研究目前尚处于动物实验层面。本研究基于动物实验，探讨瑞舒伐他汀强化治疗对心肌梗死PCI术后小鼠心肌线粒体稳态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取清洁级别雄性小鼠，均为5周，共40只，体质量25～35 g，随机分为假手术组、模型组、瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组，每组10只。假手术组与模型组在手术前1周予以5 mg/kg的蒸馏水灌胃；瑞舒伐他汀1组在手术前1周予以5 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃；瑞舒伐他汀2组在手术前1周予以20 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃。各组均为每日1次，共灌胃8周。

1.2 研究方法

1.2.1 心肌梗死小鼠模型的制备[5]采用常规方式麻醉小鼠，同时借助呼吸机辅助通气治疗，潮气量6～8 mL/kg，呼吸频率70～80次/min，进行开胸操作，再将小鼠心包组织等进行分离、结扎。造模成功标准：采用心电图检测，其ST段出现向上抬高的现象，并且动脉远端心肌组织出现明显苍白的现象。小鼠造模成功以后，均予以PCI模拟治疗，再分别予以药物或者蒸馏水干预。假手术组在开胸操作结束后，不予以结扎处理，脱臼处死小鼠，并获取心肌组织标本，固定，再予以不同浓度梯度的乙醇溶液，包埋，切片处理。

1.2.2 血流动力学参数 在药物干预8周后，连接多导生理记录仪，另外在小鼠的右颈总动脉位置处再连接塑料心导管，待心室稳定后记录血流动力学参数指标，包括左心室舒张末期内压(LVEDP)、左心室收缩压(LVESP)、左心室压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 心肌线粒体获取 血流动力学参数指标检测完毕以后，脱臼处死小鼠，获取心脏组织标本，予以适量的生理盐水溶液进行清洗，再将其他非心肌组织标本清除干净。

1.2.4 心肌线粒各相关标志物蛋白表达检测 将获取的部分心肌组织置于-80 ℃冰箱中保存，采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测线粒体自噬相关指标PINK1、Beclin1蛋白表达。其余部分心肌组织用于获取线粒体。主要采用差速离心法获取心肌组织中线粒体，具体操作方法：取上述心肌组织，剪碎，获得匀浆溶液，加入蔗糖、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二胺四乙酸(EDTA)介质，另外再设置溶液的pH为7.4，进行离心操作，800 r/min离心10 min，静置，获取上层溶液，再次进行离心操作，1 000 r/min离心10 min，获取下层沉淀，1 000 r/min离心10 min，定量检测主要采用考马斯亮蓝法。

Western Blot实验：取组织，消化，予细胞裂解液，提取蛋白，凝胶电泳，电转移，转膜，封闭，一抗抗体(PINK1、Beclin1、Drp1、Mfn2、COXⅣ、PGC-1α、Tfam，1∶200；GAPDH，1∶1 000)，4 ℃培养，过夜，于第2日予磷酸盐吐温缓冲液(PBST)，再予二抗(1∶1 000)孵育。

1.2.5 线粒体膜电位 取上述获取的心肌线粒体约0.5 mg，再予以适量的JC-1染色溶液，于37 ℃的黑暗环境下进行水浴操作，10 min左右即可，再予以适量的苹果酸溶液以及谷氨酸溶液，采用荧光分光光度计检测，获取红色和绿色荧光值，再计算线粒体膜电位。

1.2.6 ATP合成活力 于上述反应介质(蔗糖溶液+苹果酸+谷氨酸)，依次予以适量的线粒体以及荧光素酶溶液，记录发光强度，同时再予以适量的二磷酸腺苷(ADP)溶液，采用荧光分光光度计检测ATP合成活力、活性氧(ROS)生成速率。

1.3 观察指标 观察各组血流动力学相关指标、线粒体膜电位及线粒体ATP合成活力。

2 结 果

2.1 4组血流动力学参数指标比较 瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组、模型组LVESP、+dp/dtmax水平均低于假手术组，-dp/dtmax、LVEDP水平高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，瑞舒伐他汀2组+dp/dtmax水平升高，-dp/dtmax、LVEDP水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；瑞舒伐他汀2组+dp/dtmax高于瑞舒伐他汀1组(P<0.05)，-dp/dtmax低于瑞舒伐他汀1组(P<0.05)。详见表1。

表1 4组血流动力学参数指标比较(±s)

2.2 4组心肌线粒体功能学指标比较 与假手术组比较，模型组心肌线粒体功能学指标膜电位、ATP合成活力降低，ROS生成速率增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，瑞舒伐他汀2组心肌线粒体功能学指标膜电位、ATP合成活力升高，ROS生成速率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 4组心肌线粒体功能学指标比较(±s)

2.3 4组心肌线粒体自噬PINK1、Beclin1蛋白表达比较 与假手术组比较，瑞舒伐他汀2组、瑞舒伐他汀1组、模型组PINK1、Beclin1蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，瑞舒伐他汀2组、瑞舒伐他汀1组PINK1、Beclin1蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图1。

图1 Western Blot检测心肌组织中PINK1、Beclin1蛋白表达

表3 4组心肌线粒体自噬相关指标PINK1、Beclin1蛋白表达比较(±s)

2.4 4组心肌线粒体Drp1、Mfn2蛋白表达比较 与假手术组比较，瑞舒伐他汀2组、瑞舒伐他汀1组、模型组心肌线粒体Drp1蛋白表达升高，模型组Mfn2蛋白表达降低，瑞舒伐他汀1组、瑞舒伐他汀2组Mfn2蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，瑞舒伐他汀2组、瑞舒伐他汀1组心肌线粒体Drp1蛋白表达降低，Mfn2蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图2。

图2 Western Blot检测Drp1、Mfn2蛋白表达

表4 4组心肌线粒体Drp1、Mfn2蛋白表达比较(±s)

2.5 4组心肌线粒体生物合成相关标志物蛋白表达比较 与假手术组比较，瑞舒伐他汀1组、模型组心肌线粒体生物合成指标COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；瑞舒伐他汀2组COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达均高于模型组(P<0.05)，瑞舒伐他汀1组PGC-1α高于模型组(P<0.05)；瑞舒伐他汀2组心肌线粒体生物合成指标COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表达均高于瑞舒伐他汀1组(P<0.05)。详见表5、图3。

图3 Western Blot检测心肌线粒体生物合成相关标志物蛋白表达

表5 4组心肌线粒体生物合成相关标志物蛋白表达比较(±s) 单位：%

3 讨 论

高兰兰等[6]的研究发现，经过8周瑞舒伐他汀强化治疗以后，能够明显提高心肌梗死病人的摄氧量水平，另外予以低剂量瑞舒伐他汀治疗后，心肌梗死病人的摄氧量水平无明显改善。吴建峰[7]研究也发现，经过10周的瑞舒伐他汀强化治疗以后，能够有效提高冠心病病人摄氧量水平，大约可提高17.9%，另外予以低剂量瑞舒伐他汀干预后，冠心病病人耗氧量并无明显的变化。上述研究均表明，瑞舒伐他汀强化治疗更加具有时效性，但是目前关于其生物学机制尚且需要进一步探讨。本研究观察瑞舒伐他汀强化治疗与低剂量瑞舒伐他汀对心肌梗死PCI模拟治疗小鼠线粒体稳态及心室重构的影响，揭示瑞舒伐他汀强化治疗在心肌梗死疾病中潜在的机制。

+dp/dtmax水平能够揭示机体左心室心肌收缩力程度。本研究发现，瑞舒伐他汀强化治疗可明显提高+dp/dtmax水平，另外低剂量瑞舒伐他汀虽然也得到一定程度的提升，但与模型组比较差异无统计学意义，此研究结果进一步表明瑞舒伐他汀强化治疗心肌梗死PCI术小鼠，对于其心室重构时效性更优。心肌功能的稳定与线粒体稳态之间关系密切。心肌梗死引起心室重构以后，心肌组织长时间处于缺血缺氧环境下，并且线粒体是关键靶向位置，一般常见的表现有氧化应激反应、能量代谢过程出现障碍等，甚至包括多条凋亡信号通路的启动等[8]。本研究发现，瑞舒伐他汀能够明显抑制心肌组织中线粒体ROS产生，但是与低剂量瑞舒伐他汀干预比较，瑞舒伐他汀强化治疗改善心肌线粒体膜电位、心肌线粒体ATP的生成更明显。

若线粒体损伤较严重，并且难以恢复时，则心肌细胞线粒体开始启动线粒体自噬过程，目的是为了清除机体内出现异常的线粒体[9]。本研究发现，心肌梗死模型小鼠心肌细胞中自噬水平明显上升，如PINK1及Beclin1水平出现异常上升的现象，其中PINK1属于线粒体自噬的启动因子，Beclin1主要构成自噬体关键成分之一。有研究表明，敲除PINK1、Beclin1基因的小鼠模型心功能异常明显，并且线粒体出现异常堆积的现象，小鼠心肌梗死面积异常增大[10]。说明心肌梗死病人机体内可以通过线粒体自噬水平，维持线粒体稳态，但是并不能有效清除异常的线粒体。本研究发现，瑞舒伐他汀可吸纳并提高心肌细胞线粒体内PINK1、Beclin1水平。

心肌细胞中线粒体并不是单独存在的，主要介导融合以及分裂过程，用以维持线粒体稳态，进一步有效发挥心肌细胞线粒体功能[11]。本研究发现，模型组小鼠Mfn2蛋白水平异常下降，另外Drp1蛋白水平异常上升，初步说明心肌梗死机体可能介导氧化应激反应，进一步打破心肌细胞线粒体融合和线粒体分裂之间的稳态。本研究结果显示，瑞舒伐他汀干预后能够明显提高心肌细胞线粒体Mfn2蛋白水平，分析其原因：瑞舒伐他汀通过提高心肌细胞线粒体Mfn2蛋白水平，进一步提高心肌细胞的抵抗能力，尤其当心肌细胞处于缺血以及缺氧环境下的抵抗能力，同时控制ROS水平，以及对线粒体渗透性也发挥抑制作用[12]。瑞舒伐他汀强化治疗维持线粒体融合以及分裂稳态的过程主要与心肌细胞线粒体自噬有关，瑞舒伐他汀可能通过上调线粒体融合水平，从而使线粒体处于一个新的平衡状态[13]。

细胞能量供应过程主要与其线粒体的功能和数量存在关系，并且线粒体的数量是关键因素，这一过程称之为线粒体生物合成，其中PGC-1α属于上述过程的关键因子[14-15]。本研究发现，模型组PGC-1α及其下游靶基因Tfam蛋白水平出现异常下降现象，并且COXⅣ水平也下降，说明心肌梗死病人PGC-1α表达上升，同时合并功能异常。另外本研究结果还显示，瑞舒伐他汀干预后，能够明显提高心肌细胞PGC-1α水平，并且瑞舒伐他汀强化治疗后Tfam、PGC-1α、COXⅣ蛋白水平明显上升[16]。

综上所述，与5 mg/kg的瑞舒伐他汀用药方案进行比较，瑞舒伐他汀强化治疗后心肌梗死PCI术后心肌线粒体稳态更加具有实效性，并且瑞舒伐他汀可以调节线粒体能量代谢过程以及心肌细胞线粒体生物合成，而低剂量的瑞舒伐他汀并没有上述干预效果，分析其原因可能与心室泵血功能有关。瑞舒伐他汀强化治疗与其低剂量之间在调控线粒体稳态方面可能与调控PGC-1α水平差异有关[11]。