基于UPLC-MS/MS 对阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的质量控制

王琰，和燕玲，李春燕，朱灵龙，潘婷，叶继威，段光玉，邵伍军

（浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000）

磺酸及其衍生物在药物合成过程中常被用作烷基化或催化试剂，未反应完全的磺酸及其衍生物可能与药物合成过程中微量的醇类发生酯化反应，产生磺酸酯类基因毒杂质[1]。磺酸酯类是I 类潜在基因毒杂质，能够直接或者间接地将自身结构上的烷基残基转移至富电子的DNA 碱基上引起DNA 突变或重组，甚至有可能是诱发肿瘤发生的物质[2-3]。药物中磺酸酯的检测属于药物中有机杂质检测范畴，但其限度的控制需控制到μg/g 级别，所以磺酸酯的标准比普通有机杂质严格了近百倍乃至几千倍，高效液相色谱、气相色谱法已无法满足限度要求，目前常用的方法为高效液相-质谱联用或气相-质谱联用法[4]。调查发现，甲磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯的检测方法报道较多，未发现异丙苯磺酸甲酯和异丙苯磺酸乙酯的检测方法，本方法基于UPLC-MS/MS 首次建立了阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯和异丙苯磺酸乙酯检测方法，为阿卡波糖、米卡芬净钠质量控制和工艺优化提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY I UPLC Class-TQ-S micro 超高效液相-串联质谱仪（美国Waters 公司）； Milli-Q Advantage A10 超 纯 水 仪（ 美 国Merck 公 司）；XPE205 电子天平（瑞士梅特勒公司）。

甲酸铵为质谱纯（德国Sigma 公司）；甲醇为色谱纯（美国Merck 公司）；异丙苯磺酸甲酯，异丙苯磺酸乙酯对照品，纯度均为98%（桑迪亚医药技术上海有限责任公司）。阿卡波糖（浙江海正药业生产），米卡芬净钠（浙江海正药业生产）。

1.2 对照品及样品溶液配制

对照品溶液配制：分别精密称取异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯对照品适量，用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀释成含有异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯浓度均为500 ng/mL 的对照品储备溶液。

样品溶液配制：称取阿卡波糖样品适量用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀释成含有阿卡波糖4 mg/ mL 的溶液；称取米卡芬净钠样品适量用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀释成含有米卡芬净钠4 mg/mL 的溶液。

1.3 色谱-质谱条件

色 谱 柱： Agilent Eclipse Plus C18RRHD 50 ×2.1 mm ，1.8 μm；流动相A 为0.01 moL/L 甲酸铵水溶液，流动相B 为甲醇；梯度洗脱程序：0 ～ 4.0 min，30% ～ 80% B；4.0 ～ 5.0 min，80% B；5.0 ～ 5.1 min，80% ～ 30% B；5.1 ～ 7.0 min，30% B；柱 温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：5.0 μL。

质谱条件：电喷雾电离（ESI）正模式；离子化电压3.5 kV；离子源温度150 ℃；雾化气温度500 ℃；雾化气流速1 000 L/h；锥孔电压30 V；检测模式多反应监测（MRM）。质谱参数见表1。

表1 异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯多反应监测参数Tab.1 Multiple reaction monitorning（MRM） parameters for detection of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2 结果与讨论

2.1 流动相的确定

试验考察了甲酸-甲醇、甲酸-乙腈、甲酸铵-甲醇、甲酸铵-乙腈等流动相体系，试验结果表明，以甲醇为有机相，异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的质谱响应值明显高于乙腈；由于异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯易在溶液中形成加铵母离子，以甲酸铵缓冲盐为无机相，既能保证体系中稳定的铵离子浓度，还能保证异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯液相中的保留时间及pH 值的稳定，且能增强离子化效率；试验中使用甲酸体系时，对异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯有降解作用。因此本试验选择0.01 moL/ L 甲酸铵水溶液-甲醇流动相体系进行梯度洗脱。

2.2 色谱柱的确定

试验考察了Agilent Eclipse Plus C18、Waters BEH C18、Waters CSH C18、Waters HSS T3 色 谱 柱，发 现异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯及阿卡波糖、米卡芬净钠在Agilent Eclipse Plus C18色谱柱均有保留，分离度较好，选择粒径1.8 μm，柱长为50 mm 的色谱柱，流速设为0.3 mL/min，同时调节流动相有机相初始比例为30%进行梯度洗脱，既可以保证柱效及适宜的保留时间，也可以增强离子化效率，异丙苯磺酸甲酯的保留时间约为2.47 min，异丙苯磺酸乙酯的保留时间约为3.68 min。

2.3 质谱条件的优化

将浓度分别为500 ng/mL 异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯对照品储备液以10 μL/min 的流速通过蠕动泵注入质谱仪中，在正离子模式下进行一级质谱全扫描，调节锥孔电压及离子化电压，使异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯母离子响应值最高。全扫描结果表明，锥孔电压为30 V，离子化电压为3.5 kV时，异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯响应值最高；在流动相条件下异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯主要以[M+NH4]+形式存在，由于流动相中含有NH4+，[M+NH4]+峰响应值较稳定，所以选择异丙苯磺酸甲酯[M+NH4]+m/z 为232.1 作为母离子，异丙苯磺酸乙酯[M+NH4]+m/z 为246.1 作为母离子。二级质谱扫描时，每种化合物选择2 个特征离子作为定量和定性离子，优化碰撞能量，使每组离子质谱响应值最高。二级质谱结果表明，异丙苯磺酸甲酯离子对232.1/91在碰撞能量为12 eV 时响应值最高，232.1/201 在碰撞能量为12 eV 时响应值次高；异丙苯磺酸乙酯离子对246.1/201 在碰撞能量为15 eV 时响应值最高，246.1/91 在碰撞能量为13 eV 时响应值次高。异丙苯磺酸甲酯选择232.1/91 离子对为定量离子，异丙苯磺酸乙酯选择246.1/201 离子对为定量离子。基于UPLC-MSMS 分析异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯MRM 特征定量离子质谱图如图1。

图1 异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯定量离子质谱图Fig.1 Quantitative ion chromatograms of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2.4 专属性试验

在1.3 节，进样空白溶液（30%甲醇水溶液）、对照品溶液、样品溶液。由图2 可知，空白溶液及样品溶液对异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯测定无干 扰。

图2 空白溶液、对照品溶液、样品溶液干扰试验质谱图Fig.2 Specific mass chromatograms of blank solution,reference solution and sample solution

2.5 线性范围、检测限和定量限

采用外标标准曲线，按照“1.2 色谱-质谱条件”对配制的标准工作液进行LC-MS/MS 分析，以异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯定量离子对的峰面积对被测组分的浓度进行线性回归，得到各浓度的线性回归方程和相关系数，如表2 所示。结果表明，2 种化合物的峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数r均为0.999 9。按照定量限S/N ≥10 的要求，异丙苯磺酸甲酯的定量限为5.735 0 ng/mL；异丙苯磺酸乙酯的定量限为4.950 0 ng/mL。按照检测限S/N ≥3的要求，异丙苯磺酸甲酯的检测限为1.720 5 ng/mL；异丙苯磺酸乙酯的检测限为1.485 0 ng/mL，该方法的灵敏度较好。

表2 异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限Tab.2 Linear ranges， regression equations， correlation coeffients（r）， limit of detection（LOD） and limit of quantitation（LOQ）of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2.6 加样精密度试验

在5.00 μg/g 的添加浓度下，分别对阿卡波糖和米卡芬净钠样品进行加样精密度试验（n= 6），异丙苯磺酸甲酯的回收率在98.00% ～ 102.00%，相对标准偏差为1.49%与0.82%；异丙苯磺酸乙酯回收率在98.00% ～ 102.00%，相对标准偏差为1.37%与0.90%，如表3 所示。结果表明，该方法有较好的重现性，能满足阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯分析检测要求。

表3 阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯加样精密度Tab.3 Sample precision of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate in acarbose and micafungin sodium

2.7 准确度试验

在1.25 μg/g、5.00 μg/g、7.50 μg/g 的 添 加 浓 度下，分别对阿卡波糖和米卡芬净钠样品进行准确度试验（n= 3），异丙苯磺酸甲酯回收率在98.00% ～102.00%，相对标准偏差在0.83% ～ 2.65%；异丙苯磺酸乙酯回收率在98.00% ～ 102.00%，相对标准偏差在0.38% ～ 1.08%，如表4 所示。结果表明，该方法有较好的回收率，能满足阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯分析检测要求。

表4 阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯准确度Tab.4 Accuracy of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate in acarbose and micafungin sodium

2.8 实际样品检测

采用本方法对阿卡波糖3 批样品和米卡芬净钠3 批样品检测，结果表明，六批样品中均未检测到异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯即小于检测限限度0.4 μg/g。

3 结论

由于磺酸盐及其衍生物在药物中应用范围比较广，对人类造成的风险也比较高。针对药物中可能存在的磺酸酯基因毒性杂质控制，建立相应的安全标准，标志着基因毒性杂质的风险评估与防控迈入新的一步。针对基因毒杂质带来的安全隐患，欧洲药品监督管理局（EMA）[5]最先出台了关于基因毒杂质的控制法规，并于2006 年颁布的《基因毒杂质限度指南》首次引入了“毒理学关注阈值（TTC）”概念[6]。美国食品药品监督管理局（FDA）[7]于2008 年出台了关于基因毒杂质控制的指南草案，该草案对于基因毒杂质的控制与EMA 颁布的指南基本一致。ICH[8]也于2014 年发布了基因毒杂质研究指南，进一步肯定了“毒理学阈值”控制策略及“五分类”策略对基因毒杂质进行控制的科学性。磺酸酯类是I 类基因毒杂质，限度要求低，普通液相已无法满足检测要求，本试验首次建立了超高效液相色谱-三重四级杆质谱同时测定阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯分析方法，以0.01 moL/L 甲酸铵水溶液和甲醇为流动相，Agilent Eclipse Plus C18RRHD（50×2.1 mm 1.8 μm）为色谱柱进行梯度洗脱分离，质谱采用正离子多反应监测（MRM）模式采集数据，离子化电压3.5 kV，离子源温度150 ℃，雾化气温度500 ℃，雾化气流速1 000 L/h 进行检测，并对该方法进行了方法学验证。实验结果表明，异丙苯磺酸甲酯在5.735 0 ～ 45.880 0 ng/ mL 浓度范围内线性关系良好，异丙苯磺酸乙酯在4.950 0 ～ 39.600 0 ng/ mL 浓度范围内线性关系良好，线性相关系数r均大于0.999；异丙苯磺酸甲酯检出限和定量限为1.725 0 ng/ mL、5.735 0 ng/mL，异丙苯磺酸乙酯检出限和定量限为1.485 0 ng/mL、4.950 0 ng/mL；阿卡波糖和米卡芬净钠样品中高、中、低三个浓度水平的加标回收率在98.00% ～ 102.00%之间，相对标准偏差在0.38% ～ 4.58%之间，准确度良好；以上结果表明，该方法选择性强，灵敏度高，回收率好，适用于阿卡波糖和米卡芬净钠中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的检测，有助于该产品的质量控制和工艺优化，也可以推广到其他药物中异丙苯磺酸甲酯、异丙苯磺酸乙酯的检测。