HPLC 法测定阿扎胞苷中残留溶剂二甲基亚砜含量

赵成欣，王金玲，李丹丹，李泉妙

（国药一心制药有限公司，长春 130000）

阿扎胞苷为嘧啶核苷胞苷类似物，属于一类被称为低甲基化药物（Hypomethylatingagents）的表观遗传学（Epigenetic）抗肿瘤药。由Pharmion 制药公司研制开发，持证商为Celgene 公司，于2004 年5 月在美国批准上市，上市规格为 100 mg，商品名“Vidaza®”，是第一个骨髓增生异常综合征的治疗药物[1]。

阿扎胞苷原料合成工艺使用了二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide DMSO），根据2020 年版《中国药典》和ICHQ3C 残留溶剂指导原则相关要求，需要对原料合成过程中使用的残留溶剂进行去除，并对残留溶剂进行检查[2-3]。目前，有关阿扎胞苷原料中残留溶剂二甲基亚砜检测方法方面的研究，国内尚未见报道。本文采用高效液相色谱法（HPLC）建立了阿扎胞苷原料中残留溶剂二甲基亚砜含量的检测方法。通过专属性、重复性、准确度等试验结果表明，该方法操作简单，准确性，重现性良好，为阿扎胞苷原料质量标准的建立提供依据。

1 仪器与试剂

Waters e2695 高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器；Aglient 1260 高效液相色谱仪；

阿扎胞苷原料药（自制，180301 批、180201 批、x-180307 批）；二甲基亚砜（SIGMA，色谱纯）；超纯水（本公司自制，电阻率为18.2 MΩ·cm）；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱Agilent ZORBAX C8（5 μm，4.6×250 mm）；流 动 相 水- 乙 腈95∶5（V∶V）；流 速1.0 mL/ min；进样量5 μL；检测波长214 nm。

2.2 溶液配制

空白溶液：超纯水。

对照品贮备液：取二甲基亚砜约50.60 mg，精密称定，用超纯水溶解并定量稀释制成每1 mL 含二甲基亚砜约2.17 μg 的溶液，为对照品贮备液。

对照品溶液：精密量取2.2 节中对照品贮备液1 mL 置100 mL 量瓶中，用超纯水定量稀释至刻度，为对照品溶液。

线性溶液：精密量取2.2 节中对照品贮备液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL 分别置10 mL 量瓶中，用超纯水定量稀释定容至刻度，制成每1 mL 含二甲基亚砜分别约为5.060、10.120、20.240、24.288、32.384、40.480、48.576 μg/mL 线性溶液。

供试品溶液：称取阿扎胞苷原料约40 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，加入适量超纯水溶解后定容至刻度，为供试品溶液。

系统适用性溶液：称取阿扎胞苷原料约40 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，用超纯水适量溶解后，加入对照品贮备液0.2 mL，再用超纯水定量稀释定容至刻度，为系统溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性

取2.2 节中的空白溶液、对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液，按2.1 节中色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见图1，可见空白溶液不干扰供试品中二甲基亚砜检测；阿扎胞苷与二甲基亚砜分离度为3.4，大于2.0，拖尾因子小于1.5，理论板数大于4 000；表明该方法专属性良好。

图1 空白溶液、供试品溶液、二甲基亚砜照溶液与系统溶液对比图Fig.1 Comparison of blank solution， test solution， dimethyl sulfoxide reference solution and system solution

2.3.2 定量限与检测限

取2.2 节中对照品溶液，用超纯水逐级稀释，以信噪比（S/N）大于10 为定量限，以信噪比（S/ N）大于3 为检测限，按2.1 节中色谱条件进样测定，记录色谱图。定量限为5.060 μg/mL，检测限为0.12 μg/ mL。

取以信噪比（S/N）大于10 的定量限溶液，按2.1节中色谱条件连续进样6 针，记录色谱图。二甲基亚砜保留时间的RSD 值为0.38%，小于1.0%，峰面积的RSD 值为1.34%，小于2.0%，表明定量限重复性良好。

2.3.3 系统适用性试验

取2.2 节中对照品溶液，按2.1 节中色谱条件连续进样6 针，记录色谱图。二甲基亚砜保留时间的RSD 值为0.29%，小于1.0%，峰面积RSD 值为0.67%（n= 6）。表明该方法系统适用性良好。

2.3.4 线性与范围

精密量取2.2 节中线性溶液，按2.1 节中色谱条件进样测定，记录色谱图。以溶液浓度（μg/mL）为横坐标（X轴）、峰面积（A）为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线，所得线性方程见图2，二甲基亚砜在5.06 ～ 48.58 μg/mL 内线性关系良好。

图2 二甲基亚砜线性Fig.2 Calibration curve of dimethyl sulfoxide standard solution

2.3.5 重复性和中间精密度

取同一批次阿扎胞苷原料，按2.2 节中方法制备的供试品溶液6 份，按2.1 节中色谱条件进样测定，以外标法计算每份样品中二甲基亚砜含量。结果显示，含量测定值的RSD（n= 6）为0.8%，表明本方法重复性良好。

由不同人员、在不同时间、使用不同的仪器，重复上述操作，按外标法计算每份样品中的二甲基亚砜含量。结果显示，含量测定值的RSD 值（n= 6）为1.5%。

2.3.6 回收率试验

精密量取9 份已知二甲基亚砜含量的阿扎胞苷原料约40 mg，精密称定，分别置10 mL 量瓶中，分别加入2.2 节中的对照品贮备液0.025 mL、0.1 mL、0.2 mL 各3 份，按2.2 节中的供试品溶液配制方法制备不同水平的回收率供试品溶液。按2.1 节中色谱条件进行测定，按外标法计算回收率。结果显示，不同加样水平条件下的二甲基亚砜的平均回收率（n= 9）为100.5%，RSD 值为0.9%。

2.3.7溶液稳定性

取2.2 节中的供试品溶液，在室温下放置，分别于0h、1h、2h、4h、16h，按2.1 节中色谱条件进行测定，记录色谱图，计算RSD。结果显示，16 h 内供试品溶液中二甲基亚砜峰面积的RSD 值为1.9%，小于2.0%，表明在室温条件下供试品溶液放置16 h 稳定。

2.4 二甲基亚砜含量测定

取各批次阿扎胞苷原料，按2.2 节中方法制备对照品及供试品溶液，按2.1 节中色谱条件进行测定，以外标法计算二甲基亚砜含量，结果见表1。

表1 阿扎胞苷原料中二甲基亚砜含量测定结果（n = 2）Tab.1 Determination results of dimethyl sulfoxide in azacitidine （n = 2）

3 讨论

3.1 方法选择

据报道，目前二甲基亚砜的检测方法主要有气相色谱法、元素分析法等。但由于二甲基亚砜是极性物质，沸点为189℃，125℃时开始分解，采用气相色谱法灵敏度低，且采用水为溶剂时，对色谱柱损耗严重；而元素分析法操作繁琐、灵敏度低，不适合用于残留溶剂的检测。高效液相色谱法灵敏度高、准确性好，操作简便[6]。本文通过实验证明，采用高效液相色谱法检测阿扎胞苷原料中二甲基亚砜，具有灵敏度高、准确性好等优点。

3.2 溶剂选择

阿扎胞苷略溶于水，同时二甲基亚砜易溶于水，通过实验可知，采用水为溶剂，当供试品溶液浓度为4 mg/mL 时，溶解性良好。进一步通过专属性试验结果表明，空白溶剂不干扰样品检测，二甲基亚砜与主峰分离度良好，故选择水为溶剂。

3.3 色谱条件的确定

阿扎胞苷和二甲基亚砜均在214 nm 有紫外吸收，故选择波长为214 nm；同时，根据阿扎胞苷和二甲基亚砜的理化性质，初步选择流动相为乙腈和水，通过方法可知，当流动相中乙腈-水（95∶5）时，二甲基亚砜与阿扎胞苷及其相邻杂质峰分离度良好，拖尾因子及理论塔板数均符合规定，故流动相为乙腈-水（95∶5）；根据二甲基亚砜定量限浓度及《中国药典》中残留二甲基亚砜残留限度要求（≤0.5%），最终确定供试品浓度为4 mg/mL、进样量5 μL。

本文建立了一种阿扎胞苷原料残留溶剂二甲基亚砜的高效液相检测方法，实验结果表明，本方法操作简单、专属性强、灵敏度高、重复性、准确性好，能够准确测定阿扎胞苷原料中二甲基亚砜的含量，为阿扎胞苷原料质量标准制定提供依据。