霍氏肠杆菌β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的制备及其应用

魏 涛，王 敏，张志平，段乃心，杨 旭，黄 申，毛多斌*

（郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

β-紫罗兰酮[4-（2,6,6-三甲基-1-环己烯基）-3-丁烯-2-酮]又名芷香酮，是一种具有木香带紫罗兰花香的名贵香料，同时也是合成维生素A、E、视黄酸及β-胡萝卜素的重要中间体，广泛应用于食品、香料、化妆品和医药工业中[1-3]。β-紫罗兰酮是环化的类异戊二烯的代表，具有较强的生物活性[4]，对肿瘤的发生有抑制作用[5]，且在抗癌、抗真菌和降血脂都有一定的效果[6-9]。β-紫罗兰酮是植物次级代谢产物，采用提取的方法从植物得到的含量较低且成本昂贵[10-11]。目前，β-紫罗兰酮主要来源于以柠檬醛为原料的化学合成，但一般采用化学合成方法得到的物质为混合物[12-14]，且化学方法的工艺较为复杂、产生的废液污染环境。生物酶法制备β-紫罗兰酮是近年来发展起来的新方法，该方法具有生产成本低、专一性强、操作方便和环境友好等优势[15-16]。由于受健康生活观念的影响，消费者倾向于选择天然香料，因此天然香料具有良好的市场前景，而微生物酶法得到的香料被视为“天然香料”[17]。郑坚强等[18]利用西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）发酵液转化β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮，发酵时间8 d，产物中β-紫罗兰酮的含量只有22.36%；SCHWARTZ S H等[19]将类胡萝卜素裂解双加氧酶成功导入大肠杆菌（Escherichia coli）中进行表达，并证明了该酶能对类胡萝卜素中第9和第10个碳原子之间的双键进行有效切割。NACKE C等[20]利用类胡萝卜素裂解双加氧酶大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌的细胞破碎液催化β-胡萝卜素转化为β-紫罗兰酮，产率达到60%。

目前生物酶法制备β-紫罗兰酮存在主要问题是：催化专一性不高，反应产物较多，反应时间较长及β-紫罗兰酮产率不高等问题。本研究将源自霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）的β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因在大肠杆菌中BL21（DE3）中克隆表达，利用生物酶法催化水解β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮，获得一种适用于工业化生产β-紫罗兰酮的新型酶催化剂，优化酶法制备β-紫罗兰酮反应条件，研究成果预期为实现香精香料的绿色合成奠定理论和应用基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与质粒

霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）：本实验室筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China committee for culture collection of microorganisms，CCCCM），保藏号为CGMCC No.1.10608。克隆与表达质粒载体pET15b-SM：本实验室构建与保存。

1.1.2 试剂

β-胡萝卜素（纯度96%）：上海麦克林生化科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、限制性内切酶NdeI和SalI、PyrobestTMDNA聚合酶、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）连接试剂盒（kit ver.2.1）、细菌基因组DNA提取试剂盒（kit ver.3.0）：日本TAKARA公司；大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：德国Novagen公司；蔗糖（分析纯）、酵母浸粉（生化试剂）、氯霉素（分析纯）、10×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%。

含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，氨苄青霉素质量浓度为100 mg/L，氯霉素质量浓度为34 mg/L。

改良察氏培养基[21-22]：K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaNO30.2%，FeSO4·7H2O 0.005%，KCl 0.1%，蔗糖5%，酵母浸粉0.5%。

以上所有培养基均在121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

Y92-Ⅲ超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；Alltech Prevail C18色谱柱（25 cm×4.6 cm）：美国奥泰公司；JB-680B全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司；15K低温离心机：美国Sigma-Aldrich公司；LC2010A/C型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、SPD-M10A二极管阵列检测器：日本岛津公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR扩增及重组质粒的构建

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取霍氏肠杆菌基因组DNA（提取方法见试剂盒说明书）。按照目前已经报道类胡萝卜素9、10'双加氧酶保守氨基酸序列，设计一对引物：上游引物5'-CGCCATATGGGAGAAGTAGCGAAGGAGGAAGTAGAAG-3'，下游引物5'-CTAGTCGACTCAGTCGGTTGCTGCCA-3'，其中，CATATG为上游引物NdeI酶切位点，GTCGAC为下游引物SalI酶切位点。以霍氏肠杆菌全基因组序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系（50 μL）如下：模板（25 ng）1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（25 mmol/L）1 μL，引物（100 μmol/L）各0.5 μL，10×PBS缓冲液5 μL，ProbestTMDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，超纯水41 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min。

PCR产物经NdeI酶和SalI酶双酶切后，连接到经同样内切酶酶切的pET15b-SM上，双酶切反应体系（20 μL）如下：PCR产物/pET15b-SM（400 ng）16 μL，NdeI内切酶（15 U/μL）1 μL，SalI内切酶（15 U/μL）1 μL，10×PBS缓冲液2 μL。双酶切反应混合液37 ℃反应4 h。

连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证，经测序分析鉴定得到β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因的序列和β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的氨基酸序列。pET15b-SM是在Novogen原核表达载体pET15b基础上改造而成，在原多克隆位点添加了SalI和NsiI酶切位点，便于基因克隆以及提高蛋白表达量。

1.3.2 基因的诱导表达与蛋白质的纯化

将重组质粒转化E.coliBL21（DE3）。带有重组质粒的表达菌在含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1%接种量接到300 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2 h，使OD600nm值为0.5；加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于37 ℃继续培养4 h，4 ℃、12 000×g离心15 min。使用破壁缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl）悬浮收集菌体，超声波细胞粉碎机破碎菌体，12 000×g离心15 min，得到粗酶液。进一步采用镍柱亲和层析（洗脱缓冲液：20mmol/LTris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L imidazole）和分子筛Sephacryl TM S-200 HR column（洗脱缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/L NaCl；洗脱速度为：1 mL/min）纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelectrophoresis，SDS-PAGE）来检测纯化效果。

1.3.3β-胡萝卜素9,10'双加氧酶酶活力的测定

β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的酶活标准反应体系如下[23-25]：0.5 mg/mLβ-胡萝卜素、10 mmol/L三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（tris（2-carboxylethyl）phosphine hydrochloride，TCEP）、5%辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（octylthioglucoside，OTG）、10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.5%Tween 80、1 mmol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、100mmol/LNaCl、80mmol/L Tricine/KOH缓冲液（pH8.5）和0.4 U/mL双加氧酶酶液。以不含有酶液的上述反应体系作对照组，40 ℃酶解60 min，加入37%的甲醛终止反应。测定酶活计算相对酶活。相对酶活：以最适反应条件下，对应酶活为参考值，其他条件下酶活与最适反应条件下酶活的比值。

β-胡萝卜素9,10'双加氧酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟生成1 μmol的β-紫罗兰酮所需要的酶量为一个活力单位（U/mL）。

高效液相色谱（HPLC）法检测反应产物，其色谱条件为：色谱柱为Alltech Prevail C18柱（25 cm×4.6 cm），采用二极管阵列检测器，流动相为正己烷∶甲基叔丁基醚（95∶5，V/V），洗脱速度为1.0 mL/min，在波长460 nm检测。分别量取0、30 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、500 μL、700 μL、800 μL、900 μLβ-胡萝卜素储备液于10支25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，分光光度法测460 nm处吸光度值，以蒸馏水为空白对照，根据所得数据制定标准曲线。得到线性方程为y=0.2764x+0.0051（相关系数R2=0.9999）。式中，x表示β-胡萝卜素水溶液的质量浓度（μg/mL），y表示峰面积。

1.3.4 重组β-胡萝卜素9，10'双加氧酶酶学性质研究

（1）最适反应温度

在不同温度（22.5～50 ℃）下反应60 min，比较酶活性的大小，确定最适温度。

（2）最适反应pH值

在不同pH值（6.0～10.5）的缓冲液中检测酶活，所用缓冲液为磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0～7.5）、Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH7.5～9.0）和CAPS缓冲液（50 mmol/L，pH 9.0～10.5），再确定最适反应pH值。

（3）酶浓度对β-紫罗兰酮产量的影响

在反应体系中分别添加不同质量浓度的β-胡萝卜素9,10'双加氧酶（0～0.6 U/mL），检测β-紫罗兰酮产量。

（4）底物浓度对β-紫罗兰酮产量的影响

在酶活为4 U/mL的反应体系中添加不同浓度底物浓度的β-胡萝卜素（0～800 mg/L），检测β-紫罗兰酮产量。

2 结果与分析

2.1 重组质粒双酶切结果验证

连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切，结果见图1。由图1可知，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因的PCR扩增的碱基长度约为1 500 bp。经过对重组质粒进行测序，得到编码β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的核苷酸为1 485 bp。

图1 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification electrophoresis of β-carotene-9,10'-dioxygenase gene

2.2 β-胡萝卜素9，10'双加氧酶基因序列分析

连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切的基因序列分析，结果见图2。由图2可知，该β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因包含1 485 bp碱基，编码494个氨基酸。

图2 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶基因的序列Fig.2 Sequence of β-carotene-9,10'-dioxygenase gene

2.3 β-胡萝卜素9，10'双加氧酶基因的扩增及表达

重组质粒在E.coliBL21（DE3）中表达后，通过超声波破壁、镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-200 HR column处理，得到纯化重组胡萝卜素9,10'双加氧酶，SDS-PAGE分析结果见图3。由图3可知，该酶分子质量约57 kDa。

图3 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶SDS-PAGE纯化结果Fig.3 SDS-PAGE purification results of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.4 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶催化反应产物β-紫罗兰酮

β-胡萝卜素标准物和β-胡萝卜素9,10'双加氧酶水解产物HPLC分析结果见图4。由图4可知，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶具有裂解β-胡萝卜素9,10'双键的活性，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶可以转化β-胡萝卜素制备β-紫罗兰酮。

图4 β-胡萝卜素标准物（a）和β-胡萝卜素9,10'双加氧酶水解产物（b）HPLC分析结果Fig.4 HPLC analyse results of β-carolene slandard (a) and β-carotene-9,10'-dioxygenase hydrolysates (b)

2.5 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶酶学性质的研究

2.5.1β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的最适反应温度

温度对β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的影响结果见图5。由图5可知，随着温度在22.5～40 ℃范围内的升高，相对酶活也在逐渐升高；当反应温度达到40 ℃时，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的相对酶活达到最大值；当反应温度高于40 ℃时，酶活逐渐降低。因此，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的最适反应温度为40 ℃。

图5 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的最适反应温度Fig.5 The optimal reaction temperature of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.5.2β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的最适反应pH值

pH值会改变位于酶活性中心、底物和辅酶的解离状态，进而改变酶与底物的结合状态以及催化水平[26-27]。pH值对β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的影响结果见图6。由图6可知，随着pH值在6.0～8.5范围内的增加，相对酶活逐渐增加；当pH值为8.5时，相对酶活达到最大值；当pH值＞8.5时，相对酶活下降。因此，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶最适反应pH值为8.5。

图6 β-胡萝卜素9,10'双加氧酶的最适反应pH值Fig.6 Optimal reaction pH of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.5.3 酶浓度对β-紫罗兰酮产量的影响

酶浓度对β-紫罗兰酮产量的影响见图7。由图7可知，随着酶活在0～0.4 U/mL范围内的增加，β-紫罗兰酮的相对产量逐渐增加；当酶活为0.4 U/mL时，β-紫罗兰酮的产量达到最大值，为115.9 mg/L；随着酶活＞0.4 U/mL之后，β-紫罗兰酮的产量逐渐下降。因此，最适酶活为0.4 U/mL。

图7 酶活对β-紫罗兰酮产量的影响Fig.7 Effect of enzyme activity on β-ionone production

2.5.4 底物浓度对β-紫罗兰酮产量的影响

底物浓度对β-紫罗兰酮产量的影响见图8。由图8可知，随着底物质量浓度在0～500 mg/L范围内的增加，β-紫罗兰酮产量逐渐增加；当底物质量浓度为500 mg/L时，β-紫罗兰酮的产量达到最大值，为123.6 mg/L；当底物质量浓度＞500 mg/L之后，β-紫罗兰酮产量逐渐下降。因此，最适底物质量浓度为500 mg/L。

图8 底物质量浓度对β-紫罗兰酮产量的影响Fig.8 Effect of substrate mass concentration on β-ionone production

2.6 最佳反应条件下β-紫罗兰酮产量

在温度40℃，pH值8.5，β-胡萝卜素质量浓度为500mg/L，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶酶活0.4 U/mL的最佳反应条件下，β-紫罗兰酮产量结果见图9。由图9可知，β-胡萝卜素9,10'双加氧酶在最佳条件下反应12 h，生成的β-紫罗兰酮产量为142.3 mg/L，产率达到79.4%。结果表明，该酶可以高效催化合成β-紫罗兰酮，具有很好的工业应用价值。

图9 在最佳反应条件下β-紫罗兰酮产量Fig.9 β-ionone yield under the optimal reaction conditions

3 结论

本实验在霍氏肠杆菌中发现了一种能够高效催化降解β-胡萝卜素的类胡萝卜素9,10'双加氧酶的菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608。采用基因工程方法在大肠杆菌E.coli中克隆表达该双加氧酶基因，经镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-200等方法制备了该酶蛋白，分子质量为57 kDa。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度和反应pH值分别为40 ℃和8.5。在最佳反应条件：底物β-胡萝卜素质量浓度500 mg/L，类胡萝卜素9,10'双加氧酶酶质量浓度0.4 U/mL，反应温度40 ℃，水解反应12 h，反应pH 8.5，β-紫罗兰酮产量为142.3 mg/L，产率达到79.4%。综上所述，霍氏肠杆菌β-胡萝卜素9,10'双加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡萝卜素，制备β-紫罗兰酮，具有较好的工业应用前景。