两种工艺制备双价肾综合征出血热灭活疫苗的安全性及免疫原性评价

张峰典，张颖，李文娟，梅可佳，张朔，孙超，孙宏亮

1.吉林省药品审核查验中心，吉林 长春130062；

2.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春130012

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由汉坦病毒（Hantavirus，HV）引发的一种自然疫源性疾病［1］，患者主要表现为出血、发热及肾损伤等症状，该病在我国较高发，约占全世界病例的90%［2-3］。该病毒可分为30多个血清型，Ⅰ型和Ⅱ型在我国较流行［3］，其中感染野鼠型患者死亡率较高，而感染家鼠型患者致死率相对较低［4］。目前尚无特效治疗药物，预防该病最有效的措施仍是接种疫苗［5-6］。

我国生产的双价肾综合征出血热灭活疫苗生产用细胞主要有原代地鼠肾细胞和原代沙鼠肾细胞两种，均采用10 L转瓶工艺进行培养，操作复杂且可控性差。细胞工厂因具有操作简单、可控性好等优点已广泛应用于疫苗行业［7］，但应用于双价肾综合征出血热灭活疫苗的制备尚未见相关报道。为此，本实验利用细胞工厂工艺制备双价肾综合征出血热灭活疫苗，并与原有10 L转瓶工艺制备的灭活疫苗进行比较，评价其免疫原性及安全性。

1 材料与方法

1.1细胞及病毒 原代地鼠肾细胞来源于12～14日龄SPF级健康地鼠肾脏，由长春生物制品研究所有限责任公司制备；PS-6株（双价肾综合征出血热病毒Ⅰ型毒种）工作种子库（批号：出工P20151202）和L99株（双价肾综合征出血热病毒Ⅱ型毒种）工作种子库（批号：出工L20151205）为长春生物制品研究所有限责任公司疫苗三室保存。

1.2实验动物 SPF级小白鼠（10～12日龄，雌雄各半，体重10～12 g，共360只）、清洁级大耳白家兔（6月龄，雄性，体重2.0～2.5 kg，共6只）和SPF级豚鼠（6～8周龄，雌雄各半，体重250～400 g，共36只）均由长春生物制品研究所有限责任公司动物室饲养并提供。本实验均以科研为目的对实验动物进行养殖和使用，且按照《国家实验动物管理法规》（国务院令第676号）动物伦理相关规定进行。

1.3主要试剂及仪器 10 L转瓶购自四川蜀牛玻璃仪器厂；40层细胞工厂购自康宁生命科学有限公司；Protein Molecular Weight Marker（low）购自日本TaKaRa公司；Sepharose 4FF凝胶柱购自美国GE公司。

1.4双价肾综合征出血热灭活疫苗的制备 分别应用40层细胞工厂、10 L转瓶两种不同工艺培养原代地鼠肾细胞，按0.01～0.1 MOI分别接种出血热病毒Ⅰ型和Ⅱ型工作种子批毒种，用病毒维持液培养72～96 h后收获病毒液，每隔3～4 d收获1次，添加新的病毒维持液后，可重复收获3～5次，但10 L转瓶仅可重复收获1～2次，细胞即明显脱落。收获的病毒液经病毒灭活、超滤浓缩、Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化、除菌过滤后即为单价原液，将出血热病毒Ⅰ型和Ⅱ型单价原液按照1∶1等体积混合，再加入氢氧化铝佐剂（终浓度为0.50 mg／mL）和人血白蛋白稳定剂（0.2%），制备为双价肾综合征出血热灭活疫苗半成品。此外，10 L转瓶工艺制备疫苗时还需加入终浓度为50μg／mL的硫柳汞防腐剂。采用细胞工厂和转瓶工艺各制备3批疫苗（批号分别为GY01、GY02、GY03和ZY01、ZY02和ZY03）。对单价原液和成品进行各项指标检定。

1.5病毒形态观察 分别取1批细胞工厂工艺制备的单价原液Ⅰ型（批号：GY01-Ⅰ）和单价原液Ⅱ型（批号：GY01-Ⅱ）及1批10 L转瓶工艺制备的单价原液Ⅰ型（批号：ZY01-Ⅰ）和单价原液Ⅱ型（批号：ZY01-Ⅱ），用透射电子显微镜观察负染后的病毒形态。

1.6病毒鉴定 分别取1批细胞工厂工艺制备的单价原液Ⅰ型（批号：GY02-Ⅰ）和单价原液Ⅱ型（批号：GY02-Ⅱ）及1批10 L转瓶工艺制备的单价原液Ⅰ型（批号：ZY02-Ⅰ）和单价原液Ⅱ型（批号：ZY02-Ⅱ），经SDS-PAGE分离病毒原液，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为12%，考马斯亮蓝染色，进一步对蛋白条带进行观察。

1.7安全性分析

1.7.1家兔刺激试验 家兔右侧后肢股四头肌局部消毒后，经肌肉注射两种工艺制备的疫苗1 mL，阴性对照注射同体积同浓度的氢氧化铝佐剂。家兔均于给药后48 h处死，纵向切开股四头肌，通过肉眼观察判断注射部位肌肉的刺激反应。注射剂刺激反应评分标准如下［8］：0级为给药部位无肉眼可见明显反应；1级为给药部位轻度充血（直径在0.5 cm以下）；2级为给药部位中度充血（直径在1.0 cm以下）；3级为给药部位重度充血、红肿、肌肉变性；4级为出现肌肉褐色变性、坏死（直径在0.5 cm以下）；5级为肌肉严重变性，出现大片坏死。

1.7.2豚鼠主动过敏性试验 取6只豚鼠，经腹腔注射两种工艺制备的疫苗，0.5 mL／只，每日1次，连续注射3日，每日观察豚鼠行为、特征。并将6只豚鼠于首次致敏前称量体重，平均分成两组，分别在第1次注射后第14及21日经前后肢静脉注射供试品溶液1 mL，观察30 min，看是否出现过敏性反应，若在一只动物身上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳，或倒地、抽搐、休克，或死亡现象之一者，判定为过敏性反应。

1.8免疫原性分析 分别将两种不同工艺制备的疫苗经后腿肌内接种家兔，1.0 mL／只，每批4只。继续饲养14 d后，进行第2次免疫，方法和剂量与第1次免疫相同。第1次免疫后4周采血，分离血清，按照《中国药典》三部（2015版）各论“双价肾综合征出血热灭活疫苗（地鼠肾细胞）中的3.4.6效价测定法”测定中和抗体滴度，家兔的Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒中和抗体滴度均应不低于《中国药典》三部（2015版）标准1∶10。

2 结果

2.1病毒颗粒形态 电镜观察显示，细胞工厂工艺制备的单价原液Ⅰ、Ⅱ型和10 L转瓶工艺制备的单价原液Ⅰ、Ⅱ型病毒颗粒均为100 nm左右的粗糙圆形颗粒，均与HV一致，见图1。

图1 两种工艺制备的Ⅰ型和Ⅱ型单价原液的电镜观察（×40 000）Fig.1 Electron microscopy of typesⅠandⅡvaccine bulks prepared by two processes（×40 000）

2.2病毒鉴定 12%SDS-PAGE分析显示，细胞工厂工艺制备的单价原液Ⅰ、Ⅱ型和10 L转瓶工艺制备的单价原液Ⅰ、Ⅱ型主要显示两条蛋白带，相对分子质量分别为70 000～73 000和约50 000，见图2。

图2 两种工艺制备的Ⅰ型和Ⅱ型单价原液的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile typesⅠandⅡvaccine bulks prepared by two processes

2.3安全性

2.3.1家兔刺激试验 两种工艺分别制备的3批疫苗对家兔注射部位的肌肉均无刺激性，均为1级反应；病理观察显示，注射局部肌肉组织均未见与疫苗相关的病理变化，两种工艺制备的疫苗家兔刺激试验结果无明显差异，见图3。表明两种工艺制备的疫苗安全性一致。

图3 两种工艺制备的疫苗注射部位肌肉刺激性试验Fig.3 Muscle irritation at injection site of vaccines prepared by two processes

2.3.2豚鼠主动过敏试验 采用两种工艺制备的疫苗均未出现豚鼠过敏性反应，未观察到豚鼠发抖、干呕、竖毛、连续喷嚏或咳嗽3声及以上，也未发现紫癜和呼吸困难等现象中的2种或以上，所有豚鼠均未出现步态不稳、抽搐、倒地、休克、二便失禁等症状或死亡。

2.4免疫原性 每批疫苗免疫的4只家兔其Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒中和抗体滴度均大于1∶10，高于《中国药典》三部（2015版）标准，表明两种工艺制备的双价肾综合征出血热灭活疫苗免疫原性均良好。

3 讨论

细胞工厂具有细胞贴壁紧密且不易脱落的特点，更适合贴壁细胞的生长，因此，越来越多的疫苗生产用贴壁细胞应用细胞工厂培养。目前，细胞工厂培养技术发展迅速，相较于转瓶，其具有操作便捷，可控性好，占用空间较少等优点，受到国内外研究者的高度关注［9-10］，相关研究表明，其优势优于转瓶，且相较于生物反应器，无类似的应用限制（符合生产要求的车间供液管路及气体管路）。鉴于以上优势，细胞工厂将越来越广泛地应用于疫苗行业。

本研究对采用细胞工厂和原10 L转瓶工艺分别制备的疫苗进行了疫苗特性、免疫原性研究及安全性评价，结果表明，两种工艺制备的双价肾综合征出血热灭活疫苗质量高度相似，细胞工厂工艺能够替代原10 L转瓶工艺。细胞工厂工艺操作简便，可减少开口次数，大幅降低染菌风险，而且节约成本；另外，细胞工厂更适合细胞生长，且细胞质量均一，能够大幅提高产品的批间一致性［11-12］，因此，细胞工厂工艺的应用将越来越广泛，有望逐步替代转瓶工艺［13-15］。但细胞工厂工艺制备的双价肾综合征出血热灭活疫苗应用于人体的安全性及免疫原性仍需进一步临床评价。