2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组4型毒株分离鉴定及其VP1基因特性分析

丛山日，刘红波，许丹菡，张名，冯昌增，黄小琴，孙浩，杨昭庆，马绍辉

1.中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明650118；2.威海市人力资源和社会保障局，山东威海5323368

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）主要由肠道病毒（enteroviruses，EV）感染引起的［1］。肠道病毒为单股正链RNA病毒，目前分为肠道病毒A~L及鼻病毒A、B、C共15类，包含上百种血清型。柯萨奇病毒A组4型（coxsackievirus A4，CV-A4）属于A组肠道病毒（EV-A），大多数CV-A4感染者不会产生或产生轻微的临床症状，但也可引起急性弛缓性麻痹症（acute flaccid paralysis，AFP）、疱疹性咽峡炎（herpangina，HA）、无菌性脑膜炎等多种疾病［1］。肠道病毒71型（EV-71）和柯萨奇病毒A组16型（CV-A16）是引起HFMD的主要病原体［2］，但近年来，CV-A6、CV-A10和CV-A4等引起的HFMD的比例逐渐上升［3-4］。各肠道病毒引起的HFMD临床表现类似，难以区别［5］。

本研究对2019年云南省分离得到的8株CVA4毒株的VP1核苷酸序列进行遗传特性分析，从而了解CV-A4的流行和变异情况，为该地区HFMD的防治提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1毒株及细胞 从2019年昆明市某医院根据《手足口病诊疗指南（2018）》［6］诊断并收集的HFMD患者的粪便中分离得到CV-A4分离株，随机挑选8株进行遗传特征分析；人横纹肌肉瘤RD细胞、人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞由中国医学科学院医学生物学研究所遗传室保存并提供。

1.2主要试剂 病毒RNA提取试剂盒Axygen Body Fluid DNA／RNA Miniprep Kit购自美国Axygen公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit购自日本Ta-KaRa公司。

1.3病毒分离培养 严格按照《手足口病预防控制指南（2009版）》［7］的要求进行样品处理和病毒分离。分别将生长状态良好的RD细胞、Vero细胞和KMB17细胞消化制成2×105个细胞悬液并接种至24孔板中，37℃，5%CO2条件下培养；待细胞生长为致密单层后，弃细胞培养液，PBS洗涤细胞2次，对照组加入500μL细胞培养液，实验组加入500μL由0.22μm滤膜处理过的病毒液（MOI=0.1），缓慢摇动后将细胞板置恒温培养箱培养2 h；病毒完全吸附后，补加1 mL细胞维持液，继续将细胞板置培养箱中培养，待细胞出现细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），置-20℃冰箱进行反复冻融。

1.4病毒RNA提取 按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA。

1.5引物设计及合成 以NCBI GenBank数据库下载的CV-A4毒株的全基因组序列［GenBank序列号：105／Taian／SD／2017（MK658832）］为参考序列，利用Primer-BLAST对引物序列进行分析，设计CV-A4毒株的VP1序列引物。CVA4-VP1F：5′-ATGGGAGCAGGGCAAAAGAA-3′（位置：2 348~2 367），CVA4-VP1R：5′-TGTCGCATCCTTGGGCTGTT-3′（位置：3494~3 475），产物长度为1 127 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.6逆转录聚合酶链反应（reser v e transcription-polymerasec h ainreaction，RT-P CR）及病毒血清型鉴定 根据PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit说明书进行RT-PCR反应。反应条件：50℃逆转录35 min，94℃预变性2 min，共35个循环：94℃变性0.5 min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，最后72℃再延伸10 min。阳性扩增产物送昆明擎科生物科技有限公司进行测序，使用Sequencher软件对序列进行拼接，利用NCBI BLAST工具对拼接序列进行比对。参考文献［8］对病毒血清型进行判定。

1.7序列分析 以参考株的地域来源和分离时间为依据，利用NCBI的Nucleotide数据库筛选出279株国内外病毒参考株（见表1），这些病毒参考株由6个国家不同地区于1949—2019年，从HFMD、急性迟缓性麻痹症（acute flaccid paralysis，AFP）及HA患者等不同健康状况的人群中分离而来。利用Mega 6.06软件的邻位拼接法（neighborjoining method，NJ）对分离株和参考株的VP1序列进行分析，根据文献［9］构建系统进化树图。使用Geneious 9.0.2软件对分离株与参考株的VP1序列进行核苷酸一致性和氨基酸同源性分析，将比对后的VP1核苷酸序列翻译为氨基酸序列，与39株国内外CV-A4参考株VP1氨基酸序列进行变异位点分析。

表1 部分CV-A4参考株的基本信息Tab.1 Basic information of partial CV-A4 reference strains

续表1部分CV-A4参考株的基本信息Tab（Continued）.1 Basic information of partial CV-A4 reference strains

2 结果

2.1CV-A4分离株 从2019年昆明市妇幼保健院收集的459份HFMD患者的粪便中分离得到26株CV-A4分离株中，随机挑选8株CV-A4云南分离株进行遗传特性分析，序列已上传至NCBI GenBank数据库。将8株云南分离株分别命名为K38／YN／CHN／2019（简称K38，基因登录号：MT591569）、K147／YN／CHN／2019（简称K147，基因登录号：MT591570）、K200／YN／CHN／2019（简称K200，基因登录号：MT591571）、K216／YN／CHN／2019（简称K216，基因登录号：MT591572）、E118／YN／CHN／2019（简称E118，基因登录号：MT591573）、E140／YN／CHN／2019（简称E140，基因登录号：MT591574）、E176／YN／CHN／2019（简称E176，基因登录号：MT591575）和E194／YN／CHN／2019（简称E194，基因登录号：MT591576）。

2.2完整V P1序列分析 通过测序、序列拼接及与参考毒株比对发现，8株CV-A4云南分离株完整VP1序列由915个核苷酸构成，编码305个氨基酸。8株CV-A4云南分离株与CVA4／High Point／USA／1949／AF081295（简称原型株）的核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为83.4%~84.6%和97.0%~98.0%。与其他国内CV-A4参考株相比，核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为87.7%~97.0%和97.7%~99.3%。8株CV-A4云南分离株相互比对，核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为91.0%~99.9%和97.7%~100.0%。其中K38与E194的氨基酸同源性高达100%，表明这两株分离株亲缘性较近。见表2。

表2 8株CV-A4云南分离株之间及其与其他CV-A4参考株之间的核苷酸一致性和氨基酸同源性对比分析（%）Tab.2 Comparative analysis of homologies of nucleotides and amino acids between eight CV-A4 Yunnan isolates and other CV-A4 reference strains（%）

2.3氨基酸变异位点分析 与原型株及部分国外CV-A4参考株VP1氨基酸序列比对发现，8株CVA4云南分离株和大部分中国参考株氨基酸序列S102A、I262V和Y285H较为保守。本研究的分离株与原型株相比，K38、K200、E140和E194存在6个氨基酸变异位点，K147、K216、E118存在8个氨基酸变异位点，E176存在9个氨基酸位点。根据VP1氨基酸位点比对发现，T28V、A34T、S102A、A200T、I262V、Y285H和R303H具有较高的突变频率。见图1。2.4V P1序列遗传进化分析 将8株云南分离株与GenBank数据库中279株CV-A4参考株基于完整VP1序列（915 nt）进行系统进化分析。将CV-A4毒株分为A、B、C、D4个基因型，其中C组基因型可分为C1~C5 5个基因亚型：C3亚型由2006年中国四川和2014年俄罗斯报道的分离株构成；C5亚型由2013年俄罗斯和2016年中国天津报道的分离株构成；C4亚型主要由印度2011年报道的分离株构成；C1亚型主要由1996—2006年中国各地区报道的分离株构成；C2亚型主要由2006—2019年中国分离株构成，C2基因亚型又可以分为分支1、2和3。A组基因进化分支由1948年美国北卡罗来纳州生活污水中分离得到High Point（CV-A4原型株）构成，B组基因进化分支由1999年非洲东部肯尼亚国家分离得到的11023.1株构成，D组基因进化分支由1株日本分离株JR构成。本研究中8株云南分离株均属于C2基因亚型的分支1，见图2。

图1 8株云南CV-A4分离株与其他CV-A4参考株VP1氨基酸序列差异分析Fig.1 Difference in amino acid sequences between CV-A4 Yunnan isolates and other CV-A4 reference strains

图2 CV-A4 VP1基因核苷酸序列的种系进化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on CV-A4 VP1 nucleotide sequence

3 讨论

肠道病毒属于小RNA病毒，病毒复制的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）缺乏校对及错配修复机制，因此肠道病毒经常发生变异［9-11］。肠道病毒VP1序列具有与病毒血清型对应的遗传多样性，通常作为肠道病毒分型及进化树图分组的依据［8］。但由于不同研究选取参考株VP1序列的长度、数量、分离年份及地域的不同，导致构建的进化树图拓扑结果存在差异［12］。史晓燕等［13］选取于2009—2015年报道的67株CV-A4毒株，将其分为A、B和C 3个基因进化分支，C型基因进化分支进一步分为C1和C2，C2分为C2a和C2b，中国分离株主要位于C2b的分支2。本研究参考JI等［9］对于全球CV-A4毒株的进化分支分型标准，选取6个国家多个地区于1949—2019年分离报道的279株CV-A4毒株作为参考株，基于完整VP1序列构建进化树图。根据进化树图提示，C1和C3基因亚型主要由1998—2007年中国报道的CV-A4毒株构成；C2基因亚型主要由2007—2019年中国报道的毒株构成；C4和C5基因亚型主要由印度和俄罗斯于2011年以后报道的毒株构成的。提示中国大陆的CV-A4原始株可能为C1和C3基因亚型。2007年后，中国大陆CV-A4优势毒株被C2基因亚型的毒株取代，C2亚型进一步分化为3个分支，分支1由2006—2019年中国多个地区报道的CV-A4分离株构成，是我国CV-A4优势毒株。本次分离得到的CV-A4毒株属于C2基因亚型的分支1。本研究更加清晰地展示了全球CV-A4毒株随时间和地域迁移产生的差异。

肠道病毒VP1蛋白是重要的中和抗原因子［14-16］。将CV-A4的VP1氨基酸序列进行比对发现，所有中国分离株S102A、I262V和Y285H较为保守，产生较为稳定的位点突变，提示中国CV-A4分离株形成了比较稳定的地域进化特征；中国CV-A4分离株VP1氨基酸序列同源性高于97.7%，提示其中和抗原位点相对保守，有利于我国CV-A4疫苗的研究。

此外，本研究利用RD、KMB-17和Vero细胞对病毒进行分离，经过3次盲传，仅RD细胞出现CPE，提示CV-A4对于不同细胞的敏感性存在差异。是否因不同细胞表面的受体不同，进而影响CV-A4在除了RD细胞外其他细胞株上的增殖，尚需进一步研究。

本研究对于CV-A4完整VP1序列进行分析，有利于动态了解该地区CV-A4毒株基因变化情况，扩展了CV-A4基因库，对加强CV-A4的监测力度、了解CV-A4在我国引起的相关疾病并掌握其遗传进化趋势提供了实验室数据。