结核分枝杆菌PknG抑制内毒素介导的巨噬细胞炎症免疫应答

彭章丽 沈瑶 付雪峰

遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科结核病区（贵州遵义563000）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性传染病，严重威胁着人类健康。据2019年WHO报道，截至2018年，全球结核病患者达1 000 万左右，中国是全球30 个结核病高负担国家之一，结核病发病率及耐药结核病发病率居全球第二，给我国人民的健康带来严重威胁［1］。Mtb 是一种典型的胞内病原体，主要通过呼吸道进入人体。吸入的Mtb 遭遇宿主免疫防御系统的攻击，Mtb 被肺部巨噬细胞吞噬，进一步引起T 细胞、B 细胞聚集形成肉芽肿，研究表明在活动性结核病及结核分枝杆菌潜伏感染病中，肉芽肿的形成、数量及形态学上都存在很大差异［2-4］。越来越多的证据表明，促炎免疫应答能够有效控制Mtb 感染，抑制免疫应答能促进Mtb 在巨噬细胞内的存活，从而有效逃逸巨噬细胞对Mtb的攻击［5］。Mtb 与宿主之间通过复杂的免疫调节作用维持免疫平衡状态，能够有效清除Mtb，部分Mtb 效应蛋白会抑制该过程的发生［6］。目前越来越多的研究报道，Mtb 相关基因参与调控Mtb 感染宿主细胞的免疫调节作用。同时，Mtb 感染巨噬细胞后释放大量的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6 及IL-1β［7-8］，但Mtb 哪些效应分子参与了该过程的调节作用及机制有待进一步研究。

真核样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPKs）是与信号识别和适应性反应相关的调节元件，Mtb 编码11 种从PknA 到PknK 的真核源性的STPK，它们参与多种细胞过程，包括细胞形态，葡萄糖和谷氨酰胺转运，吞噬体-溶酶体融合以及转录因子的表达或活性。其中PknG 及PknH 与真核丝氨酸/苏氨酸家族蛋白同源性更高。Mtb PknG 由Mtb Rv0410c基因编码，包括与分枝杆菌细胞成分结合的胞外谷氨酸结合段，因此，PknG 能够提呈谷氨酰胺。研究表明PknG 能够促进分枝杆菌在巨噬细胞内的存活［9］。进一步研究结果表明PknG 通过Rab7l1抑制吞噬溶酶体的融合促进分枝杆菌在巨噬细胞的存活［10］。SecA2 依赖性蛋白输出系统在Mtb 抑制吞噬溶酶体的融合过程中扮演着重要的角色，其中SapM 和PknG 是通过SecA2 途径输出的两种关键效应子［11］。研究表明SapM 也可以通过抑制NF-κB 及MAPKs 调节细胞因子的改变调节分枝杆菌在巨噬细胞内的存活［11］。Mtb 感染巨噬细胞的过程中，PknG 抑制吞噬溶酶体的融合从而促进Mtb 在巨噬细胞内的存活，作为同样分泌效应的SapM 分子能通过抑制吞噬溶酶体的融合及抑制炎症细胞因子的表达共同促进Mtb 在巨噬细胞内的存活。由此提出假设，Mtb PknG 蛋白是否能抑制感染巨噬细胞炎症细胞因子的表达。

脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞反应性氧化分子（ROS）的产生，然后激活NF-κB 信号通路。既往研究表明结核分枝杆菌RD-1区域主要分子CFP-10及ESAT-6 分子通过抑制LPS 诱导的炎症细胞因子发挥作用。有研究认为脂多糖LPS 是TLRs 受体的分子配体，能够激活细胞的炎性反应，促进IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性细胞因子的分泌，在结核分枝杆菌感染过程中可通过TLR4 受体结合促进炎症免疫应答释放大量验证细胞因子。因此，本研究通过构建PknG-pET28a 同源重组质粒，经IPTG 诱导表达，镍柱及不同浓度咪唑纯化及透析结核分枝杆菌PknG 蛋白，western blot 验证PknG 蛋白，最终通过TLR4受体激动剂LPS刺激巨噬细胞，检测LPS激活炎症免疫应答，PknG 处理后，用LPS 处理巨噬细胞不同时间点，然后检测相关炎症细胞因子的表达，为进一步了解结核分枝杆菌分泌蛋白PknG 抑制巨噬细胞炎症细胞因子的表达提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂DNA 聚合酶，限制性内切酶和T4 DNA 连接酶均购自TAKARA（日本）。引物，寡核苷酸，质粒提取试剂盒和凝胶提取试剂盒购自Sangon Biotech（China）。Pfu UltralI Fusion HSDNA Polymerase 高保真酶购自Stratagene 公司，DNA 胶回收和质粒小提试剂盒购自Qiagen 公司，Trans 2K plus、DH5α 感受态细胞购自北京全式金公司，EcoR I、XhoI 等限制性内切酶及购于Takara 公司，PageRuler 购自Thermo 公司。细胞裂解液、PMSF购自碧云天公司，Commas-R250 上海生工，超灵敏ECL 化学发光试剂盒购自上海天能公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体购自proteintech 公司。

1.2 构建Mtb PknG-pET28a 原核表达质粒以Mtb H37Rv 基因组为模板，利用引物PknG-F 及PknG-R 扩增Mtb 目的基因PknG。利用EcoR I 和Xhol I 酶切回收扩增产物和载体pET-28a，连接酶切片段，转化DH5α 感受态细胞，选单克隆点进行PCR 及DNA 测序验证，将质粒转化到BL21 感受态细胞中。

1.3 重组蛋白的表达纯化

1.3.1 重组蛋白的诱导表达优化表达条件，在20 mL 的Luria Bertani（LB）培养基中进行了PknG的小规模诱导表达。用不同浓度IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）和诱导温度（16、25、37 ℃）进行诱导表达。然后大规模诱导表达PknG，重组菌株在含有卡那霉素的LB 培养基中于37 ℃，250 r/min 振荡生长6 h，直至OD600 达到0.6 至1.0 之间，1 mmol/L 的IPTG 16 ℃诱导，250 r/min 振荡培养16 h，分别收集诱导前及诱导后菌体沉淀，用于后期验证，验证表达成功后，将上述诱导后的菌液于4 ℃下250 r/min振荡2 h，将离心管放于-80 ℃冻30 min，37 ℃融化30 min，反复冻融3 次，加入DNase（100 μg/mL）（1∶500），4 ℃静置30 min，通过在冰上以200 W 的功率使用5 s on/5 s off 超声波处理细菌30 min 以裂解。4 ℃12 000 r/min 30 min分离上清液和沉淀。取出100 μL 上清液备用，挑取少许沉淀加PBS 重悬；再加入5×loading buffer，将上清及沉淀进行SDS-PAGE分析蛋白。western blot 检测带有His 标签的PknG蛋白的表达。SDS-PAGE分析时，将SDSPAGE 胶放入考马斯亮蓝R-250 染液中染色5 h 以上，然后脱色，观察胶图，确定蛋白是否表达。

1.3.2 重组蛋白的纯化将具有亲和标签的重组蛋白按照标准的Ni-亲和纯化程序进行纯化。SDSPAGE 确定蛋白在上清后，用0.45 μm 的无菌过滤嘴过滤。将过滤后的蛋白质液与已经用裂解缓冲液平衡过的His-Ni-NTA 亲和柱上（Thermo Fisher Scientific，USA）充分混合，吸回离心管中，4 ℃过夜；用1×bind buffer 清洗柱子3 次，将过夜后的蛋白镍混合液再次上柱，以增加蛋白的回收量。用1×bind buffer 清洗柱子3 次，接取蛋白液标记为FT1；依次用50、100、200 mmol/L 的咪唑清洗柱子3次，分别接蛋白液标记好；然后用Strip buffer终止，标记为Strip；将每个浓度挑取第一个及最后一个用于SDS-PAGE 胶，然后考马斯亮蓝染色。用分子量小于目标蛋白大小的浓缩管过滤，经12 000 r/min离心30 min，剩下的即是目标蛋白PknG。

1.4 结核分枝杆菌PknG 蛋白与RAW264.7 细胞相互作用

1.4.1 重组PknG 蛋白对巨噬细胞的作用6 孔板中巨噬细胞5×105个/mL，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养12 h 后换入新鲜的培养液。实验分为三组：第一组用10、50、100 μg/mL 的重组PknG 蛋白预处理巨噬细胞2 h；第二组：用10、50、100 μg/mL的重组PknG 蛋白预处理巨噬细胞2 h，然后予100 ng/mL LPS 处理0、12 和24 h；第三组中只加入100 ng/mL LPS 作用于巨噬细胞0、12 和24 h。于不同时间点收集细胞上清，用于ELISA 检测；1×PBS洗细胞3 遍，用Trizol 裂解细胞用于后续实验。

1.4.2 荧光定量PCR 检测炎性细胞因子的mRNA水平表达量本实验采用荧光定量PCR 技术，检测LPS 诱导细胞后PknG 蛋白对炎症细胞因子mRNA 的表达水平。将上述步骤1.4.1 收集的细胞裂解液，按照RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，经反转录后，荧光定量检测炎性因子TNF-α、IL-6 mRNA 表达量。

1.4.3 ELISA 检测炎性细胞因子的蛋白表达水平将1.4.1 中收集的上清液，按照ELISA 相关步骤检测TNF-α、IL-6 的蛋白表达水平。

1.5 统计学方法采用Graphped prism 6.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功表达PknG 蛋白Mtb 进入机体后，通过一系列的免疫防御机制抵御宿主免疫系统的攻击，Mtb 相关基因参与结核分枝杆菌的感染过程，通过原核表达相关蛋白进一步探讨Mtb PknG 的作用及其机制研究。在NCBI 上查询获得PknG 全基因序列，通过构建PknG-pET28a 融合表达质粒，进一步表达及纯化Mtb PknG 蛋白。将PknG-pET28a重组质粒转化至E.coli BL21 表达株中，通过优化表达条件，最终在16 ℃条件下诱导获得PknG蛋白，通过镍柱纯化、咪唑洗脱及透析获取纯化的PknG 蛋白，测定浓度后保存于-80 ℃。考马斯亮蓝染色验证IPTG 诱导浓度（图1A），SDS-PAGE 验证纯化后的PknG 蛋白（图1B），western blot（图1C）结果表明成功表达及纯化Mtb PknG 蛋白。

图1 表达结核分枝杆菌PknG 蛋白Fig.1 Purification the Mycobacterium tuberculosis PknG protein

2.2 PknG 蛋白抑制LPS 诱导炎性细胞因子的表达用PknG 蛋白预处理巨噬细胞后用LPS 作用于巨噬细胞，Real-time PCR 及ELISA 结果表明PknG明显抑制炎症细胞因子TNF-α 及IL-6 的mRNA 及蛋白质表达（图2）。

图2 PknG 抑制炎症细胞因子TNF-a 及IL-6 的表达Fig.2 PknG inhibited the expression of TNF-a and IL-6

3 讨论

Mtb 是胞内病原菌，已与人类共同进化数千年，越来越多的证据表明，宿主-病原体相互作用促进了Mtb 与其宿主的共同进化［12-14］。在这个过程中，Mtb 可以通过各种途径来操纵巨噬细胞活化并在巨噬细胞内建立适当的增殖环境以防止消除［12-14］。宿主细胞通过肉芽肿形成一个相对无菌状态，维持机体与病原体的相对平衡。相反，病原体通过一系列的机制逃逸宿主免疫系统的攻击，通过影响宿主细胞一系列的信号通路促进Mtb 在巨噬细胞内的存活，达到与宿主细胞共存，如抑制抗菌肽的产生、阻止吞噬溶酶体的成熟、抑制巨噬细胞的凋亡、抑制炎症的激活，促进巨噬细胞的自噬，这些机制同样也限制了Mtb 感染中的适应性免疫应答的激活［12-14］。因此，Mtb 许多毒力因子都参与到抵御巨噬细胞免疫攻击的相互作用中，Mtb STPKs 是与信号识别和适应性反应相关的调节元件，本研究进一步阐明Mtb PknG 在LPS 诱导的巨噬细胞炎症免疫应答中的作用。

Mtb 相关毒力分子参与炎症免疫应答，从而调控Mtb 在巨噬细胞内发挥的免疫逃逸作用，且病原体在感染的早期可以对宿主的免疫系统进行调控，这对病原成功建立感染和长期的潜伏感染非常重要，KHAN 等［15］的研究认为PknG 与结核分枝杆菌潜伏感染有关。研究证明，诸如TNF-α、IL-1β和IL-12 等免疫调节分子是宿主抵抗Mtb 感染的免疫防御系统的重要组成部分［11］。因此，进一步研究Mtb PknG 的相关作用尤为重要。本研究成功纯化结核分枝杆菌PknG 蛋白为研究结核分枝杆菌相关分子在结核病诊断及治疗中奠定基础。冯金栋等［16］也通过蛋白纯化的方式表达及纯化结核分枝杆菌Rv2041c 蛋白，并进一步了解该蛋白在结核病诊断中的作用。另外，本研究发现PknG 蛋白预处理巨噬细胞后，LPS 作用于巨噬细胞，PknG 蛋白能明显抑制LPS 所致的炎症免疫应答，抑制细胞因子TNF-α 及IL-6 的产生，且对TNF-α 的抑制效果明显强于IL-6，据相关文献报道TNF-α 及IL-6 的产生与结核分枝杆菌毒力之间存在明显的负相关［17-18］，说明PknG 蛋白可能作为毒力分子参与结核分枝杆菌的感染过程，与既往研究一致［9，19-21］。SWAIN 等［22］的研究认为PknG 可作为抑制剂抑制结核分枝杆菌ATP 靶点，从而调整结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活；SONG 等［23］研究认为PknG 可作为泛素连接酶调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞的免疫应答；既往研究认为结核分枝杆菌PknG 可通过影响吞噬溶酶体融合［9］、自噬［21］及炎症免疫应答促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。其他的研究结果表明Mtb 相关蛋白可发挥类似PknG的抑制免疫应答的作用，HA 等［24］研究认为Mtb 分泌蛋白ESAT-6 通过NF-κB 及MAPKs 信号通路抑制LPS 诱导的巨噬细胞炎症免疫应答，可参与Mtb免疫逃逸机制。

脓毒血症是一种由全身过度炎症引起的疾病，由于过度产生促炎因子而引起。AHMED 等［25］研究认为Mtb PPE18 蛋白能够抑制LPS 诱导小鼠感染模型中的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 的产生，可作为控制脓毒血症的一个潜在治疗靶点。本研究中表达纯化的PknG 蛋白能够明显抑制LPS 产生的炎症细胞因子的表达，尤其影响TNF-α 的产生，且LPS 作为TLR4 受体的激动剂，由此推测结核分枝杆菌PknG 是否通过TLR4信号通路影响炎症细胞因子的表达需进一步深入研究。关于Mtb PknG 是否通过调控Mtb 炎症免疫应答机制促进Mtb 在巨噬细胞内的存活，有待进一步研究。

综上所述，本研究通过体外表达及纯化Mtb PknG蛋白抑制了LPS介导的炎症细胞因子TNF-α，IL-6 的表达，可能作为在结核分枝杆菌感染合并脓毒血症过程中治疗的一个潜在靶点。