食管鳞癌预后生物标志物的挖掘及其通路分析

田琴琴 李昂 李佳莹 谢俞宁 仵红娇 张雪梅，

华北理工大学1生命科学学院，2公共卫生学院（河北唐山063210）

食管癌是世界上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的统计，食管癌的死亡率在世界范围内排名第六，发病率排名第七［1］。在中国，食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为食管癌主要的组织病理类型［2］。ESCC 在确诊时多为中晚期，且好发于老年人，其5年生存率较低。筛选更有效的ESCC 预后生物标志物，有助于评价预后，并有可能为ESCC 提供新的治疗靶点及理论依据。

近年来，随着高通量测序技术的发展，产生了大量基因表达谱数据。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）是一个大型的癌症基因组公共数据平台，它可为研究者提供海量的基因组变异、mRNA 表达、DNA 甲基化等数据。基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）是专门用于储存芯片和高通量测序等数据的公共平台，使用相关生物信息学知识筛选出差异表达基因，绘制癌组织样本与正常组织样本差异表达基因火山图［3］。本研究挖掘了TCGA 和GEO 数据库中的ESCC 表达谱数据，结合生物信息分析，探索ESCC的预后影响因素，从而为ESCC 的治疗提供新的思路和可能的靶点。

1 材料与方法

1.1 基因表达数据来源该研究所使用的ESCC基因表达谱数据来源于GEO（GSE17351、GSE20347 和GSE100942）［4-6］和TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/，版本号：v27.0）数据库。

1.2 差异表达基因筛选使用R 语言limma 程序分析三个GEO 数据集中ESCC 癌组织和癌旁组织的差异表达基因（|Log2FC|＞1，P＜0.05），用ggplot2程序绘制火山图。使用R语言edger程序分析TCGA数据中ESCC 癌组织和癌旁组织的差异表达基因（|Log2FC|＞1，P＜0.05）。使用Venny 2.1 工具绘制Venn 图，三个数据集和TCGA 数据库中的共同差异表达基因用于后续分析。

1.3 ESCC 预后分析使用Survival 程序对共同差异表达基因进行单因素Cox 回归分析，得到与ESCC 总生存时间显著相关的基因。进一步使用多因素Cox 回归分析，获取与ESCC 总生存时间独立相关的基因。

1.4 基质和免疫浸润分析使用TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）数据库分析食管癌中6 种免疫细胞（B 细胞，CD4+T 细胞，CD8+T 细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞）的浸润情况，并分析它们与预后相关基因的拷贝数变异和表达水平之间的相关关系。

1.5 基因集富集分析和基因集变异分析从分子特征数据库MsigDB 下载“c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt”基因集作为参考基因集。根据差异表达基因的表达量中位数，分为高表达组和低表达组。使用Clusterprofiler 和GSVA 程序分别进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）和基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）。

1.6 统计学分析应用R 软件（v3.6.0）和SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析。使用配对t检验分析癌组织与正常组织之间的差异表达基因。所有分析均采用双侧分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌差异表达基因筛选通过对GEO 中三个ESCC 数据集的癌组织和癌旁组织进行分析，在GSE17351、GSE20347和GSE100942三个数据集中分别筛选出288 个（171 个上调，117 个下调），1 057 个（477 个上调，580 个下调）和857 个（333 个上调，524 个下调）差异表达基因（图1A-1C）。以上三个数据集与TCGA 数据库中ESCC 基因表达谱数据的共同差异表达基因有55 个，其中，TCGA 和GEO 数据库共同上调基因40 个（图1D），共同下调基因15 个（图1E）。

图1 食管鳞癌和正常组织样本中基因表达谱数据分析Fig.1 Analysis of gene expression profile in ESCC and normal tissues

2.2 差异表达基因的预后评价为了寻找食管鳞癌预后相关基因，对55 个共同差异表达基因进行了单因素Cox 回归分析。结果显示，TTK、CHEK1、FEN1、KIF14、NUP155、KIF23 和CENPE 可显著降低食管鳞癌患者总体生存时间（表1）。进一步多因素Cox 回归分析，仅TTK 可作为独立预后因素降低食管鳞癌的生存时间（coef=-1.10，HR=0.33，95%CI：0.15 ～0.69，P＜0.05）。

表1 单因素Cox 比例风险回归Tab.1 Univariate Cox proportional risk regression

2.3 TTK 表达和拷贝数变异与浸润性免疫细胞的相关性分析肿瘤微环境由肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞组成。分析食管癌中TTK 的表达与免疫细胞浸润之间的关系，发现TTK 与肿瘤纯度（r= 0.24，P= 1.1e-3）呈正相关，与树突状细胞（r=-0.28，P= 1.14e-4）的浸润水平呈负相关。未发现TTK 与B 细胞（r=0.09，P=0.20），CD8+T 细胞（r=-0.03，P= 0.70），CD4+T 细胞（r=-0.08，P=0.28），巨噬细胞（r= 0.01，P= 0.85）和中性粒细胞（r=-0.14，P= 0.07）等免疫细胞的浸润存在相关关系（图2A）。未发现TTK的拷贝数与B细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平存在相关性（图2B）。

图2 TTK 表达和拷贝数变异与免疫浸润水平的关系Fig.2 Correlation analysis of TTK expression and copy number variation with infiltrating immune cells

2.4 GSEA 和GSVA 分析GSEA 分析结果显示，TTK 主要富集在细胞周期、DNA 复制、同源重组、核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复途径（图3A）。GSVA 分析显示同源重组、细胞周期、核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复和DNA复制等途径与TTK 的高表达密切相关（图3B）。进一步表明TTK 高表达与细胞增殖过程的激活有关。

图3 GSEA 和GSVA 分析TTK 的相关富集基因集Fig.3 GSEA and GSVA analysis of TTK related enriched gene sets

使用Pearson相关性分析分析了TTK与DNA 损伤修复途径以及细胞周期途径中关键基因表达的相关性。结果发现，在mRNA水平上，DNA损伤修复途径中的RFC5、RAD54B、RAD51、PRIM1、GTF2H3、BLM 和细胞周期途径中的CCNB2、BUB1B、ORC3、CDK1、CDK2、ORC1、CDC6 与TTK 显著相关（r＞0.60，P＜0.001，图4）。

图4 TTK 与相关富集通路途径基因相关性分析Fig.4 Correlation analysis of TTK with related enrichment pathway genes

3 讨论

食管癌是全球癌症相关死亡的第六大原因，严重危害着人类的健康。我国是食管鳞癌的高发区，其发病率和死亡率均居于世界前列。近年来，尽管某些新型食管鳞癌标志物具有一定的特异性和灵敏度，但受制于实验水平和模型的限制，其临床诊断效果还存在局限性。因此，寻找食管鳞癌的差异表达基因以及预后标志物具有重大意义。本研究基于GEO 和TCGA 公共数据库，在全基因组水平上分析了食管鳞癌样本的遗传学特征，以期发现在癌症预后中的差异表达基因及潜在的标志物［7］。

在这项研究中，关注的是具有诊断和预后价值的潜在基因。基于三个数据集和TCGA 数据库的差异基因表达谱和Cox 回归分析，确认了TTK 作为食管鳞癌独立的预后潜在标志物。纺锤体装配检查点是一个参与信号级联过程的因子，可阻止有丝分裂直至所有染色体正确附着在有丝分裂纺锤体上，达到防止染色体错位的目的［8］。TTK 作为纺锤体装配检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）的核心成分，能够磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基［9］。TTK 与细胞周期及DNA 修复途径之间的相互作用是细胞复制阻滞的基础，TTK 的高表达会导致中心体扩增、SAC 过度活化和染色体不稳定［10］。TTK C-末端含有蛋白激酶结构域，能够增强染色体着丝粒定位，影响细胞正常增殖以及精确分裂，从而调控肿瘤发生［11］。

由于TTK 在维持染色体稳定性中发挥着至关重要的作用，越来越多的科研人员注意到TTK 在癌症中的潜在价值，并研究TTK 表达与肿瘤发生之间的关系。研究［12］表明，TTK 的过表达与乳腺癌较差预后有关，可作为乳腺癌进展中的潜在生物标志物。这一观点得到了证实，在69 例三阴性乳腺癌组织样本和细胞系中，肿瘤组织中的TTK的表达水平显著高于正常组织，并且与肿瘤组织大小和TNM 分期密切相关，导致患者不良预后，敲降TTK 抑制BT474 细胞的迁移和侵袭［13］。在抑制TTK 表达的细胞中，乳腺癌细胞系CC-671 识别G1/S 检查点功能失调，加速细胞有丝分裂，促进癌细胞的增殖［14］。在正常脑组织中TTK 的表达非常低，但是，在胶质瘤中TTK 表达高于正常脑组织，TTK 的表达量与胶质瘤的WHO 分期呈现正相关关系，而且TTK 过表达可加速肿瘤细胞增殖，减少患者的生存时间［15］。CHEN 等［16］研究表明TTK 在前列腺癌组织中过表达，且与患者不良预后相关，可作为候选生物标记物和潜在治疗靶点。在卵巢癌中，临床研究［17］已经证实TTK 过表达与肿瘤较差预后密切相关，并且可能与细胞周期相关。

已知TTK 在多种人类恶性肿瘤中存在过表达现象，且与较差的生存预后存在着明显的关联性。但仅在少数肿瘤中对TTK 表达和肿瘤形成的潜在机制进行了研究。过表达的TTK 激活Akt/mTOR 信号通路促进细胞增殖和凋亡，从而在胃癌细胞中发挥重要的作用［18］。研究［19］发现肝癌新药神经节苷脂的合成上调TTK 的表达，影响染色体分离和有丝分裂进程。在黑色素瘤细胞中，TTK 激活Akt，并通过B-Raf WT/ERK 信号传导形成负反馈调控通路［10］。除此之外，活化的TTK 可以通过磷酸化Smad2 和Smad3 来促进Smad 信号传导［20］，从而抑制膀胱癌的上皮-间质转化，促进膀胱癌细胞的增殖和迁移［21］。结肠癌细胞中，TTK 既能通过激活PKCα/ERK1/2 途径来促进细胞增殖，又可以抑制PI3K/AKT 途径来减少与结肠细胞分化有关的MUC2 和TFF3 的表达，从而调控结肠癌细胞分化［22］。此外，在部分肿瘤细胞中，对TTK 与肿瘤药物的功能进行了相关研究。在结肠癌裸鼠异种移植瘤模型中，新型选择性口服TTK 抑制剂联合紫杉醇展示了良好的抗肿瘤疗效，肿瘤生长抑制率为78%［23］。在卵巢癌中，TTK 在顺铂耐药卵巢癌细胞系中上调，下调TTK 可激活PI3K/AKT 信号通路调控卵巢癌细胞对顺铂治疗的敏感性［24］。

近年来，随着国内外学者对肿瘤免疫学研究逐步深入，免疫疗法可作为恶性肿瘤治疗的最新和最有希望的支柱，具有利用和激活宿主免疫系统的潜能。因此，重要的是探索在肿瘤微环境中起关键作用的新型分子生物标记物和靶向生物标记物。一些临床试验表明［25］，TTK 作为免疫抗原表位，能在不损伤正常细胞的同时诱导出强大的细胞毒性T 淋巴细胞活性，来诱导抗肿瘤免疫反应，从而对抗肿瘤细胞。虽然TTK 在许多人类恶性肿瘤中曾进行过相关基础与临床研究，然而在食管鳞癌中未发现有类似相关研究。进一步研究TTK 在食管鳞癌中的作用，发现TTK 的表达与肿瘤纯度呈正相关，而在食管癌组织样品中TTK 和浸润性免疫细胞未见或弱关联。据此提出TTK 主要在食管癌细胞而不是免疫细胞中表达，并且它们的功能可能与肿瘤微环境的免疫调节无关。

TTK 除了调控纺锤体装配检查点之外，它在中心粒复制、DNA 损伤反应过程中也起着重要作用［26］。为了进一步探讨TTK 在食管鳞癌中的潜在机制，基于TTK 的表达数据进行了GSEA 和GSVA通路富集分析。与此前文献报道一致，GSEA 和GSVA分析证实了TTK的高表达与增殖过程的激活有关。TTK 与细胞周期及DNA 修复相关分子之间的相互作用是细胞周期阻滞的基础，分析TTK 与DNA 修复途径以及细胞周期途径中的相关基因之间的关系，发现TTK 与这些途径中的一些核心基因高度相关。这些发现为食管鳞癌的发病机制提供了新的见解。

综上所述，本研究综合了TCGA 和GEO 数据库中的食管鳞癌组织表达数据，利用生物信息学方法筛选出TTK 作为独立预后基因，并推测高表达的TTK 可调控细胞周期和DNA 修复途径，从而影响食管鳞癌的发生及预后。目前，放化疗被推荐为治疗食管鳞癌的标准方法［27］。一些研究在TTK联合放化疗方面均取得了不错的结果，TTK 联合放化疗能够改变细胞周期进程，影响中心体异常程度，调节癌细胞的敏感性［28］。另外，药物联合放化疗可显著提高晚期食管癌患者的疗效、生存率及生存质量，如：多西他赛和奥沙利铂［29］。所以，TTK 还可以尝试联合一些肿瘤药物或放化疗进行相关研究。越来越多的研究人员正在关注这个未知领域，对于食管鳞癌而言，TTK 或许可以成为一个有前景的治疗靶点。