狂犬病病毒PV株在人用狂犬病疫苗中的应用及研究回顾

石磊泰 综述，李玉华，俞永新 审校

中国食品药品检定研究院，北京 102629

巴斯德所用的病毒是1882年自牛脑分离的一株狂犬病病毒（rabies virus，RV），经驯化后潜伏期变短、毒力减弱，该株病毒被命名为Paris Pasteur［3］。Paris Pasteur株经后人不同的传代适应演化出几个分支［4］，本文仅对其中一个分支PV（Pasteur virus）株在人用狂犬病疫苗中的应用及研究回顾作一综述。

1 来源和历史

1882年，巴斯德自牛脑分离到1株RV，并将其在家兔脑内连续传90代。该病毒传至50代时的潜伏期已由原来的15 d缩短为固定的7 d，且毒力也减弱，称为固定毒。将感染后7 d发病的兔脊髓取出，在室温空气中干燥后，发现病毒的毒力很快降低，一般干燥15 d后可完全减毒。巴斯德用干燥减毒的脊髓悬液给狗进行皮下免疫，由开始注射无毒的病毒悬液至逐步注射有毒的材料，结果50多头经免疫的狗均能抵抗脑内注射RV的感染［2］。

1882年巴斯德分离到的固定毒一直在兔脑内连续传代，后续不同的传代方式出现了几个不同的分支，其中PV株出现在大众视野是在1965年。PV株是1965年从阿根廷的布宜诺斯艾利斯泛美人畜共患病中心获得的，源于最初的巴斯德病毒，PV株返回法国巴斯德研究所后又进行了兔脑内系列传代，命名为PV-11，PV-11又在胎牛肾细胞传33代适应，后定名为PV株［4］。但PV株从1882—1965年间如何从法国到了南美洲的阿根廷以及中间的传代历史已无史料可循［4］，但2021年GOMES［5］公开的一篇报道能提供巴斯德病毒从欧洲到南美洲的一点线索：文中提到，1888年，巴西帝国的皇帝佩德罗二世支持巴斯德在南美洲的巴西里约热内卢开设巴斯德研究所，最初该研究所只致力于狂犬病疫苗的研发。此后，巴西的科研人员将RV接种至兔脑内，再将发病的兔子从法国的巴斯德研究所带到巴西的巴斯德研究所。这是有文献可查的巴斯德病毒从法国运到巴西，但后来如何到阿根廷再无文献可佐证。

虽然PV株的传代历史中有部分时期模糊不清，但WHO狂犬病专家委员会在1972年仍达成了共识：自巴斯德时代的RV传代历史可能已无从考证，但如果近几年的传代历史清楚，也可用于狂犬病疫苗生产［6］。会上PV株还被纳入WHO病毒种子目录清单［7］。2005年，PV株被WHO生物标准化专家委员会纳入人用狂犬病疫苗生产用毒种库［8］。

2 传代适应

2.1 在胎牛肾细胞上适应 法国巴斯德研究所的ATANASIU等［9］在1974年的工作报道中提到，用PV株在胎牛肾细胞上适应并制备了人用狂犬病疫苗，经浓缩、纯化和灭活后，在法国和少数几个国家使用了10多年。

2.2 在BHK21细胞上适应 较早关于PV株在BHK21细胞上适应传代的工作报道是法国巴斯德研究所的ERMINE等［10］在1977年开展的。

1988年，巴西布坦坦研究所的CONSALES等［11］在摸索RV在细胞瓶内的最佳培养条件时，使用的就是PV株在BHK21细胞的适应株，该适应株为法国巴斯德研究所的Sureau教授所赠。最终，CONSALES等确定用细胞瓶在BHK21细胞上培养PV株的最佳培养条件为：感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1～1，感染方式为吸附2 h，病毒最佳培养温度为33℃，最佳pH为7.4～7.6。感染后4、7、10 d收获的病毒滴度分别为5.38、5和4.23 lgLD50／0.03 mL。

1998年，同样是巴西布坦坦研究所，GALLINA等［12］为了提高RV的培养规模和产量，采用生物反应器培养病毒。将总量为6.8×108的BHK21细胞转移至含7.5 g cytodex1微载体的5 L生物反应器内，36.5℃吸附3 h后，补加L15培养基至3.7 L（牛血清含量8%），继续培养3～4 d后，弃去80%的培养基，以0.1～0.8 MOI接种PV株病毒（来源于法国巴斯德研究所），34℃吸附2 h，补加L15培养基至3.7 L（牛血清含量0.3%）。接种病毒后72、96、144、168、240 h，病毒滴度分别为6.98、7.28、6.69、6.18、6.09 lgLD50／mL，一个培养周期可收获14 000～14 500 mL病毒液。这种培养方式可实现较大规模生产RV，能满足当时工业化生产的需要。

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2.3 在Vero细胞上适应1983年，PV株在法国巴斯德研究所完成兔脑内传代2 061次后，又在Vero细胞上连续传14代进行适应，适应株命名为L Pasteur 2061／Vero 15 pass，简称PV2061［1］。

2001年，巴西布坦坦研究所的FRAZZATIGALLINA等［13］在生物反应器内用Vero细胞成功培养RV PV株。所用的Vero细胞来源于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），PV株来源于法国巴斯德研究所。Vero细胞培养至1.6×106个／mL时转移至5 L生物反应器，工作体积为3.7 L，内含10 g cytodex3微载体，细胞培养阶段用含1%牛血清的培养基。细胞培养3～4 d后按MOI 0.015加入PV株，培养病毒阶段用无血清培养基，感染病毒3 d后开始收获病毒液，连续收获4 d，共收获12 L病毒液，在未浓缩的情况下病毒滴度可达5.4～5.66 lgFFD50／mL。

2002年6月，辽宁成大生物股份有限公司（简称辽宁成大）从国外引进微载体生物反应器细胞培养技术，在大容量生物反应器内用Vero细胞成功培养制备RV PV2061株疫苗，商品名为“Speeda”［14-15］。Vero细胞来源于ATCC，PV2061株来源于美国CDC。Vero细胞连续传代，密度达（1.0～1.2）×106个／mL时转移至含25 g／L微载体的30 L生物反应器内，灌流培养。细胞培养5 d后，密度达（1.2～1.5）×107个／mL时接种PV株，更换含1%小牛血清的维持液，将反应器温度调至33～35℃继续灌流培养。培养3 d后开始收获病毒液，可连续收获18～22 d。收获液最高病毒滴度可达8.5lgLD50／mL，平均滴度为7.6lgLD50／mL。

在印度，有两家机构开展了PV株在Vero细胞上适应的研究工作。其中印度的巴斯德研究所使用的毒株是PV-11，KUMAR等［16］在2005年的工作报道中使用PV-11株在Vero细胞上培养狂犬病疫苗，开展柱层析和区带离心纯化等工艺验证的比较研究；另一家机构是印度的人用生物制品研究所（Human Biologicals Institute），使用的毒株是PV2061，SAMPATH等［17］2005年报道，在印度用PV2061在Vero细胞上制备出人用狂犬病疫苗，商品名为“Abhayrab”。

3 基因特性

早在1986—1988年，法国巴斯德研究所的TORDO等［18-20］即对PV株进行了测序，所用毒株为PV株在BHK21细胞的适应株。测得PV株的基因全长为11 932个核苷酸，GenBank登录号为M13215［21］。PV株由3'至5'端依次排列N、M1、M2、G、L5个结构基因，每个基因由3'至5'端的非编码区及编码区构成。其中在N基因的3'端之前有一段先导序列长58个核苷酸，N基因的位置为59～1 482 bp，编码区为71～1 423 bp，编码450个氨基酸；M1基因的位置为1 485～2 475 bp，编码区为1 514～2 407 bp，编码297个氨基酸；M2基因的位置为2 481～3 285 bp，编码区为2 496～3 104 bp，编码202个氨基酸；G基因的位置为3 291～4 964 bp，编码区为3 318～4 892 bp，编码524个氨基酸；L基因的位置为5 388～11 863 bp，编码区为5 418～11 846 bp，编码2 142个氨基酸。N～M1、M1～M2、M2～G、G～L基因间隔分别为2、5、5和423个核苷酸。其中M1基因即为大家熟知的P基因，M2基因即为M基因。

2015年，江苏先声卫科生物制药有限公司的科研人员开展了对PV2061株的测序工作［22］，与TORDO等的工作不同的是该PV2061株来源于美国CDC，为Vero细胞适应株，所测PV2061株的基因全长为11 932个核苷酸，GenBank登录号为JX276550［23］。与TORDO等所测的PV株相比，两个PV株的全长基因同源性为99.8%，两株病毒的基因位置和编码区位置均相同。

4 免疫保护

4.1 暴露前免疫保护2005年，印度的SAMPATH等［17］用Abhayrab肌肉注射60名健康志愿者，免疫程序为0、7、21 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位为三角肌。免疫后14、35、365 d采血检测中和抗体，14、35、365 d的GMT分别为12.69、18.19和12.26 IU／mL，且接种不良反应轻微。

2010年，菲律宾的MAGPANTAY等［24］对从印度引进的Abhayrab进行安全性和免疫原性研究，与SAMPATH等不同之处在于MAGPANTAY等采用皮内注射的方式进行免疫，免疫程序为0、7、28 d各免疫1次，每次0.1 mL，注射部位为三角肌区域。免后14、28 d采血检测中和抗体，第14和28天后，60名受试者的GMT分别为3.30和4.37 IU／mL。期间仅观察到少数轻度不良事件，无中度或重度事件发生。由 此，SAMPATH等 和MAGPANTAY等 认 为，Abhayrab具有较好的免疫原性和安全性。

2006年，国内的查力等［25］报告了辽宁成大Speeda狂犬病疫苗的安全性和免疫原性，实验组502人用Speeda免疫，对照组100人用法国维尔博疫苗免疫，免疫程序均为0、3、7、14、28 d各免疫1针，观察不良反应和免疫效果。首剂免疫后14 d，实验组与对照组抗体阳转率均为100%，GMT分别为5.2和5.6 IU／mL；第45天，实验组GMT为9.5 IU／mL，对照组GMT为9.8 IU／mL。所有接种对象均未出现局部和全身强不良反应。与法国的维尔博疫苗相比，查力等认为Speeda疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

2007年，巴西的COSTA等［26］报道了用Vero细胞生产的PV株人用狂犬病疫苗的免疫原性和安全性。该疫苗由巴西布坦坦研究所用无血清培养基生产［27］，该项研究从2002年开始历时4年完成，296名志愿者分为两组：实验组192人接种该疫苗，对照组104人接种赛诺菲巴斯德公司生产的Vero细胞疫苗。免疫程序为0、3、7、14和28 d肌肉注射各免疫1次。免后第0、14、38、90天采血检测RV中和抗体，结果显示，第14、38和90天，两组的GMT均远高于0.5 IU／mL，且实验组GMT高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。但抗体阳转率两组差异无统计学意义（P＞0.05）。最常见的不良反应为注射部位疼痛，且实验组发生次数比对照组多（P＜0.001），但所有不良反应均有良好转归，未见严重不良反应发生。COSTA等认为，该疫苗安全性和免疫原性良好。

4.2 暴露后免疫保护2005年，印度的SAMPATH等［17］关于Abhayrab的研究中涉及了暴露后免疫评价。按WHO关于狂犬病诊疗方案，Ⅱ级暴露受试者75人，Ⅲ级暴露67人，两组受试者免疫程序相同，均为0、3、7、14、30、90 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位为三角肌，两组受试者均不使用狂犬病免疫球蛋白。免后14、35、90和365 d采血检测中和抗体，Ⅱ级暴露组4 d的GMT分别为13.53、15.03、7.04、4.15 IU／mL，Ⅲ级暴露组4 d的GMT分别为15.78、8.04、9.47、7.82 IU／mL。观察期内受试者的不良反应分级为轻微到小，在2年的随访期内，这两组受试者无死于狂犬病的病例报告。

2017年，有研究对暴露后受试者采用两种接种程序：“2-1-1”程序和五针法，接种辽宁成大Speeda狂犬病疫苗以比较两种免疫程序的安全性和免疫持久性［28］。接种疫苗前采集暴露后受试者血清样本，接种疫苗后第7、14、42、180、365天分别采集暴露后受试者血清样本。在整个研究中记录每次接种疫苗后7 d内出现的征集不良反应和非征集不良事件，结果显示，研究期间无严重不良反应报告。虽然“2-1-1”程序在首次接种的不良反应发生率略高于五针法第1和第2次注射，但随后针次的不良反应发生率在两种程序中基本相似。在第42天，两种免疫程序的抗体阳转率均为100%，抗体滴度均超过0.5 IU／mL。在第180和365天，两组受试者的抗体血清浓度急剧下降，但仍有部分人具有保护性抗体（分别为75%和50%）。1年后，无实验室确认的疯犬致伤受试者发病，他们在第14和42天阳转率均为100%。Speeda狂犬病疫苗对暴露后受试者无论按“2-1-1”程序或五针法预防接种后，均有较好的安全性、免疫原性和免疫持久性。

2019年，国内有机构评价暴露后使用辽宁成大Speeda“2-1-1”程序肌肉接种狂犬病疫苗的免疫持久性及2剂加强（入组当天和第3天各加强免疫1次）免疫效果［29］。选择曾暴露后按“2-1-1”程序全程接种Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的研究对象314人，进行2针加强免疫，加强免疫前、后14 d分别采血检测IgG抗体，分析使用“2-1-1”程序后1、2、3年及经2剂加强免疫后的抗体几何平均浓度（geometric mean concentration，GMC）和抗体阳性率。结果暴露后的303人按“2-1-1”程序接种Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的抗体GMC分别为1.33、1.04和0.72 IU／mL，抗体阳性率分别为77.78%、66.67%和55.56%。暴露后的282人经2剂加强免疫后，1、2和3年组的抗体GMC分别为16.83、19.37和21.05 IU／mL，加强免疫后抗体GMC均高于加强免疫前（t分别为16.54、13.85和16.02，P均＜0.001）；抗体阳性率分别为100.00%、99.00%和100.00%。狂犬病暴露后使用“2-1-1”程序接种Speeda狂犬病疫苗具有良好的免疫持久性，3年内2剂次加强免疫后具有较好的免疫应答。

5 结语

狂犬病是一种传统的人兽共患病，除南极洲外，所有大陆均有发生，分布在150多个国家和地区。全球范围内，每年约有2 900多万人需接受狂犬病暴露后处置和疫苗接种，由狂犬病造成的经济损失估计为每年86亿美元［30］。

但狂犬病是可防可控的，接种疫苗是人类预防狂犬病最有效的策略。PV株自面世以来，在法国本土［9］、塞尔维亚［31］、伊朗［32］、突尼斯［33］、巴西［26］、印度［17］和中国［14-15］等国家用来生产人用狂犬病疫苗以防控狂犬病疫情，其中辽宁成大Speeda人用狂犬病疫苗年产能可达1 000万人份，除在国内使用，还出口到泰国、菲律宾和埃及等一带一路国家［34］。由此可认为，PV株在狂犬病防控方面发挥了一定的作用。但目前狂犬病疫情仍不容乐观，与WHO 2030年实现狂犬病清零目标仍有一定差距［35］，为了实现消除狂犬病，需要团结协作、共同努力。