响应面法优化霍山石斛多糖超微低温萃取工艺

王升贵，马荣锋

九仙尊霍山石斛股份有限公司（上海 201199）

霍山石斛属兰科石斛属多年生草本植物，主要分布于安徽省霍山县，属于国家一级濒危药用植物。霍山石斛的食用历史比较悠久，始记于《神农本草经》：“味甘，平。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳、羸瘦，强阴。久服，厚肠胃、轻身、延年”。霍山石斛含多种活性物质，其中霍山石斛多糖是其标志性成分，它具有增强免疫力[1]、抗氧化[2]、保护肝脏[3-4]、抗肿瘤[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗疲劳[8]、清咽[9]、抗炎[10-11]、增强肠道生理屏障和生化屏障等作用[12]。关于多糖提取工艺方面，有学者使用响应面法优化铁皮石斛多糖闪式提取工艺[13]、微波辅助法提取工艺[14]、复合酶法提取工艺[15]、水提法提取工艺[16-17]、超声法提取工艺研究[18]等。另有研究报道响应面法优化回流水提法霍山石斛多糖[19-20]和超声波提取工艺[21]。纵观这些多糖提取工艺，主要是在传统工艺上进行优化。此次试验采用创新的提取技术，利用响应面法对霍山石斛多糖的超微低温萃取法提取工艺进行研究与优化，得到最佳工艺条件，以期为霍山石斛的生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z. Tang & S.J. Cheng）鲜条，由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供。鉴定人为中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员。

葡聚糖标准品，Mr=50 000，中国药品生物制品检定所；苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为分析纯，市售；植物复合酶，宁夏和氏璧生物技术有限公司；蒸馏水，自制。

1.1.2 主要仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发器，金坛国胜试验仪器厂；GZX-9070MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海标仪仪器有限公司；FA2204B分析天平，上海升隆电子科技有限公司；JS39D-250多功能食品加工机（搅拌机），苏泊尔专卖店；紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超微低温萃取工艺流程

霍山石斛鲜条→超微萃取→固液分离→低温浓缩→低温连续薄膜干燥→粉碎

1.2.2 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定样品的多糖含量，多糖含量越高说明提取率越高。准确量取2 mL定容的多糖提取液，置15 mL离心管中，加入无水乙醇至一定体积分数，摇匀，于4 ℃冷藏一定时间，取出，离心（转速4 000 r/min）20 min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL容量瓶中，冷却，摇匀。准确量取1.0 mL供试品溶液，置具塞试管中，按照标准曲线制作方法测定吸光度，根据标准曲线数据和式（1）计算多糖提取率。

式中：X为样品中粗多糖提取率（以无水葡萄糖计），mg/g；C为测试样品的多糖质量浓度，mg/L；M为样品质量，g；V1为样品提取液定容总体积，mL；V2为沉淀粗多糖定容后体积，mL；V3为样品测定液总体积，mL；V4为供沉淀多糖移取体积，mL；V5为样品测定移取体积，mL。

1.2.3 响应面分析法优化霍山石斛提取工艺

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取超微研磨细度（X1）、内循环时间（X2）、料液比（X3）3个因素，采用三因素三水平的响应面分析方法进行工艺优化。通过Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，得到霍山石斛超微低温萃取的最优工艺参数。因素水平分析选取，见表1。

表1 Box-Behnken设计试验的因素及编码值

2 结果与分析

2.1 试验设计与结果

Box-Behnken设计方案及试验结果，见表2。

表2 Box-Behnken设计方案及试验结果

2.2 二次回归模型的拟合及方差分析

对表2的结果进行响应面二次回归模型拟合，方差分析结果见表3。结果表明，当置信度为95%时，内循环时间和交互项X1X3、X2X3对Y影响不明显。拟合的二次模型为：Y=59.62+1.69X1+0.46X2+1.10X3-1.48X1X2-0.25X1X3-0.50X2X3+0.15X12+2.50×10-3X22+ 0.28X32。方差结果显示，该模型的一次项X1、X3的影响极显著（p＜0.01），这表明超微研磨细度和料液比2个因素均与霍山石斛超微低温萃取的多糖提取率高低有直接关系，是多糖超微低温萃取的主要限制因子，其较小的变化可引起多糖提取率相当大的改变；超微研磨细度与内循环时间的相互作用对霍山石斛多糖提取率的影响同样达到极显著水平（p＜0.01）。而X1X3、X2X3、X12、X22、X32的影响不明显，说明超微研磨细度与料液比、内循环时间与料液比的相互作用对霍山石斛多糖提取率的高低无显著影响。而且，失拟项的p为0.134 0，没有达到显著水平，说明非试验因素对试验结果的影响不大。因此，所拟合的二次模型信任度高，能够较好地解释Y的数据群，该模型的决定系数R2=0.908，表明模型回归拟合较好。多糖提取率的预测值和实际值之间有较好的拟合度，说明该模型较适合霍山石斛超微低温萃取工艺优化的筛选。

表3 回归模型的方差分析

2.3 响应因子水平的优化

响应面图形是响应值Y对应于试验因素X1、X2、X3所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图，其可以直观地反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响。将2个因素固定在零水平，利用Design Expert 8.0.6软件可作出另外2种因素交互作用的响应曲面图及其等高线图，结果见图1～图3。从各图中的曲面变化形式的陡峭趋势，可得出超微研磨细度与内循环时间的相互作用对霍山石斛多糖提取率有较明显的影响。根据响应面试验最优值预测方法，预测出霍山石斛多糖超微低温萃取的提取率的最大值64.102%，各单因素最优值分别是超微研磨细度50.000 μm、内循环时间5.000 s，料液比1∶30（g/mL）。

图1 X1X2相互作用对霍山石斛多糖提取率影响的响应面图谱（X1=超微研磨细度，X2=内循环时间）

图3 X2X3相互作用对霍山石斛多糖提取率影响的响应面图谱（X2=内循环时间，X3=料液比）

2.4 最佳提取工艺的验证

根据响应面试验最优值预测方法，预测出霍山石斛超声波提取的最大提取率64.102%，为了进一步验证该试验结果的可性度，依据最佳条件进行试验，为利于试验操作，选取超微研磨细度50 μm、内循环时间5 s、料液比1∶30（g/mL）进行3次平行验证，霍山石斛多糖提取率平均值为64.04%，与优化预测值非常接近，从而可以说明理论值与实测值之间具有良好的拟合性，表明了所建模型的有效性，说明回归方程能较真实地反映各因素对霍山石斛超微低温萃取的多糖提取率的影响。

图2 X1X3相互作用对霍山石斛多糖提取率影响的响应面图谱（X1=超微研磨细度，X3=料液比）

3 结论与讨论

利用超微低温萃取技术进行霍山石斛提取物的制备，经响应面分析及优化，得到霍山石斛超微低温萃取的最佳工艺：超微研磨细度50 μm，内循环时间5 s，料液比1∶30（g/mL）。此条件下的霍山石斛多糖提取率为64.04%。采用超微低温萃取技术提取多糖，多糖提取率高于响应面法优化的超声波多糖提取[21]和响应面法优化的回流水提多糖法[20]。研究表明温度对石斛多糖的得率和抗氧化活性有影响，温度越高多糖得率和抗氧化性降低[22]。同时，温度对总多酚、总黄酮等活性物质均有影响，比如吴振等[23]研究灭菌温度越高，果汁中的多酚和黄酮损失越多。由此推断超微低温萃取技术对霍山石斛多糖的得率及其他易氧化的活性成分影响小。且霍山石斛药用价值和保健价值已被广泛证实，但其种植投入大且产量极低，5年只生长5 cm，以致其价格一直居高不下，充分提取其活性成分，可提升其综合利用价值，并为产品开发和产业的发展提供参考。