木枣发酵专用营养剂的研制

韩基明，杨春，杜亚军，张玲*

山西农业大学，山西功能食品研究院（太原 030031）

木枣为山西省吕梁地区和陕西省榆林地区主要生态与经济兼用树种，木枣内含丰富的营养物质和生物活性成份，是一种药食两用价值很高的天然保健食品[1]，历来深受人们喜爱。由于鲜枣在常温条件下极易发生失水皱缩、软化褐变以及发酵霉烂，生产上常将其制成干枣等加工品[2]，其附加值和对残次果的利用有限[3]。因此，开发红枣特色制品成为枣产业化的重要课题。近年来有关枣醋[4-7]、枣酒[8-9]、枣发酵饮品的开发应用有较大的发展潜力，但缺乏专用的营养助剂以满足生产中的实际需求。故研究其发酵专用营养助剂可为木枣资源的综合利用，以及枣酒、枣醋的开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木枣（采自山西临县林家坪乡木枣园）。酵母：SQB（圣琪酿酒高活性干酵母）、BV818（安琪葡萄酒活性干酵母）、AQH（安琪酿酒高活性干酵母）。酶制剂：果胶酶A（夏盛）、果胶酶B（诺维信）、果胶酶C（恒生）、酸性蛋白酶（10万 U，夏盛）、纤维素酶（夏盛）。营养添加剂（均为市购食品级）。

电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；显微镜（奥林巴斯）；菌落计数器（上海那艾精密仪器有限公司）；酒精计（河北武强县同辉仪表厂）；培养箱（金坛区西城新瑞仪器厂）；蔗糖仪（成都市青羊联合光学仪器）；气相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 枣酒生产工艺流程

1.2.2 木枣汁的制备

取干木枣（水分20%左右），清洗后，按1∶2（g/mL）加入纯净水，加热至80 ℃，保温2 h，滤出枣汁，加入1倍的纯净水2次提取，于80 ℃保温1.5 h，合并2次提取枣汁，继续加热至浓度为20%后，用0.180 mm孔径滤布过滤备用。

1.2.3 商业酵母的活化

参考文献[10]，略有改动。称取0.5 g活性干酵母于4.5 mL无菌水的试管中（复水活化用水葡萄糖含量为2%），置于35 ℃水浴中进行静置活化15～30 min，每5 min摇动1次，直至有大量气泡产生。

1.2.4 酒精度的测定

酒精蒸馏法[11]。

1.2.5 高级醇（以异戊醇和正丁醇两者的总量为代表）的测定方法

甲醇、异戊醇和正丁醇含量的测试方法为气相色谱法。相关参数：GC-9860气相色谱仪配有氢焰检测器（FID）、AHS-6890A自动顶空进样装置（山东滕州市鲁创分析仪器有限公司）毛细管色谱柱（白酒分析专用柱50 m×0.32 mm×0.5 μm）；流速：氢气30 mL/min，空气300 mL/min；载气为氮气 50 mL/min，分流比30∶1；顶空进样装置温度80 ℃；温度：甲醇、异戊醇和正丁醇标准曲线时柱温80 ℃，保留10 min，枣酒样品时柱温80 ℃，保留60 min。

1.2.6 碳源营养的选择和补充

在木枣汁（可溶性固形物含量15%）发酵过程中，分别补充添加木枣汁（可溶性固形物含量20%）、葡萄糖、果糖、蔗糖，测试并比较不同添加量（加入未发酵枣汁中）和不同添加阶段（固定添加量8%）对枣酒酒精度的影响。

1.2.7 氮源营养的选择和补充

利用酵母残渣自制氮源。将枣酒发酵结束后发酵罐底部剩余的酵母残渣放入打浆机中，转速6 000 r/min下保持5 min，采用物理破碎的方式，可将酵母的细胞壁破成碎片，便于进一步微生物分解。将破碎后的酵母渣浆倒入酶解罐中，加入蛋白酶，添加量为浆液质量的0.5%，在35～40 ℃温度下恒温0.5～1 h，取出冷藏备用。

有研究报道在酒精发酵过程中，酵母优先利用的氮源为铵态氮[12]。选用自制氮源、尿素、磷酸氢二铵、氯化铵作为氮源营养，添加到枣汁发酵液中，测定枣酒的酒精度和高级醇。

1.2.8 维生素营养的选择与影响效果

选择对酵母发酵有明显作用的B族维生素作为维生素营养添加剂，发酵24 h后通过显微镜观察酵母的生长状况和繁殖数量。

1.2.9 其他营养添加剂的选择和补充

选择海藻糖、山梨醇、氯化钠和甘油等物质作为酵母营养剂，加入可溶性固形物30%的枣汁中，观察酿酒酵母和产香酵母的生长繁殖状况，测定其对酿酒酵母和产香酵母耐高浓度底物性能的影响，将发酵液的酒精度调到12%vol，通过观察酵母的生长繁殖情况，判定其对酵母耐酒精性的影响。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对枣酒发酵的影响

由图1可知：葡萄糖最易被酵母利用，添加量6%时酒精度就可达12.2%vol，果糖添加量8%时酒精度为最高，达到12.4%vol，蔗糖利用率较低，添加量8%时酒精度可达11.1%vol，添加量超过8%后，酒精度增加不大，可能由于糖度过高，抑制酵母的生长，导致过早衰退，发酵后劲不足，添加浓缩后的木枣汁（浓度20%）作为碳源，酒精度呈缓慢增加趋势。

图1 不同碳源添加量对枣酒酒精度的影响

由图2可知，固定添加量8%，最佳添加阶段为发酵第4天，此时添加葡萄糖可使枣酒的酒精度达12.2%vol，添加果糖酒精度最高，可达12.5%vol，超过5 d后添加，酒精度大幅降低。

图2 不同添加阶段对酒精度的影响

由此可知，最佳碳源为葡萄糖和果糖，最佳添加量为6%～8%，最佳添加阶段为发酵后第4天，可使枣酒的酒精度最高达到12.2%vol～12.5%vol。

2.2 不同氮源对枣酒发酵的影响

在枣汁发酵第2天添加不同氮源营养剂，添加量均为枣汁质量的0.1%，每天测试发酵液酒精度含量，结果如图3所示。结果表明，添加氮源后，发酵液的酒精度比不加氮源的发酵液有不同程度的增加，并且增加速度快1 d，添加自制氮源的发酵液酒精度在发酵第7天最高可达12.3%vol，添加磷酸氢二铵的发酵液酒精度增加最快，在发酵第6天可达最高为11.9%vol。

图3 添加不同氮源对枣酒酒精度的影响

图4和图5表示在枣汁发酵第2天添加不同量的自制氮源后，枣汁发酵第7天对比测试的结果。结果表明：随着氮源添加量增加，发酵液的酒精度含量明显增加，添加量0.1%时，酒精度最高可达12.3%vol，但继续增加添加量后，酒精度略有降低；甲醇含量随着氮源添加量增加，略有增加；高级醇含量随着氮源添加量增加而增高。

图4 自制氮源添加量对枣酒中酒精度的影响

图5 自制氮源添加量对枣酒中甲醇和高级醇含量的影响

结果显示：在枣汁发酵液中添加有机氮源和无机氮源，均会提高发酵液的酒精度，最佳添加量为0.1%，添加过量反而会略微降低酒精度，无机氮源较有机氮源能够更快速地被酵母利用；氮源的添加略微增加发酵液的甲醇含量，影响不明显，但能显著增加发酵液中高级醇含量，这与文献报道的结论一致[13]。

2.3 不同维生素对枣酒发酵的影响

由表1可见：添加维生素B1和维生素B2对酿酒酵母和产香酵母影响不大；添加维生素B6和烟酸对酿酒酵母略有促进生长的作用，对产香酵母有较大促进作用；添加泛酸对酿酒酵母的促进作用很明显，对产香酵母的促进作用不明显；添加叶酸和硫胺素对酿酒酵母和产香酵母均具有很大的促进作用，酵母形状也明显壮大。

表1 不同维生素对枣酒发酵过程中酵母生长的影响

2.4 其他营养剂对枣酒发酵的影响

由表2可知：添加一定量氯化钠和甘油能显著提高酿酒酵母和产香酵母的耐高浓度底物性能和耐酒精性能，添加山梨醇的效果一般，海藻糖的效果最差。

表2 营养添加剂对酵母耐酒精性和耐高浓度底物性能的影响

3 结论

在木枣发酵的不同阶段适量添加发酵营养剂，可提高酵母细胞耐渗透压的能力，从而能够在高浓度底物和产物的环境中正常代谢，并且，可促进酵母繁殖生长，加快底物的消耗，降低残糖，提高出酒率，最终能够提高发酵效率，降低综合生产成本。结果表明，碳源营养剂的添加可选择枣汁和葡萄糖或果糖的混合添加方式，兼顾快速补充营养和降低成本的作用，在发酵第4天加入，最佳添加量为6%～8%；氮源营养剂的添加可选择有机氮源（自制氮源）和无机氮源（磷酸氢二铵）复合添加的方式，于发酵第2～第3天添加，保持在氨基酸态氮含量不大于400 mg/L水平下，以避免产生过多的高级醇；维生素营养剂的添加可采取将几种维生素（维生素B6、烟酸、叶酸、泛酸、硫胺素）复合添加的方式，能更好的发挥协同作用，于枣汁发酵后第2天加入，最佳添加量为0.2 mg/L；在需要高浓度枣汁发酵或发酵高酒精度的枣酒情况下，可添加抗渗透压营养剂氯化钠和甘油，其在枣汁中的添加量分别为4.2%和5.8%。