直投式商业酸乳发酵剂发酵特性评价

夏文洋 ，徐显睿 *，李翠凤 ，张宗博 ，张衡，陈政言

1. 青岛根源生物技术集团有限公司食品研究室（青岛 266000）；2. 青岛诺和诺康实业有限公司（青岛 266000）

乳酸菌是生产酸奶、风味发酵乳、发酵乳饮料、干酪、常温酸奶等发酵乳制品最重要的菌株。乳酸菌发酵剂发酵特性（包括产酸、产香、蛋白分解能力、质构特性）直接影响发酵乳制品的品质[1-3]。在实际生产中不同发酵乳产品所需发酵剂特性一般不同，尤其以杀菌型发酵乳产品对发酵剂性能要求较高，如常温酸奶和杀菌型乳饮料均需发酵剂产酸快，后酸化平缓，产丁二酮或乙醛等典型香气，赋予发酵乳极高黏稠度，使产品风味口感饱满，降低离心沉淀率。生产浓缩乳饮料需发酵剂具有长时、持续高产酸能力，对产黏性能无特殊要求；制备干酪通常选择产黏低或不产黏，产香和蛋白分解能力较强的发酵剂，有利于乳清处理和干酪成熟。因此，试验以8种常见市售商业酸乳发酵剂为研究对象，结合发酵剂中菌株构成，对发酵剂在产酸、产香、蛋白分解能力、质构和感官指标进行测试，分析不同乳酸菌菌株发酵特异性，旨在为提高发酵剂应用适宜性和产品质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂奶粉、全脂奶粉（脱脂奶粉蛋白质湿基含量33%，全脂奶粉蛋白质湿基含量25%，新西兰恒天然公司）；蔗糖（食品级，市售）；丁二酮（国药集团化学试剂公司）；邻苯二甲醛、三氯乙酸、亚硫酸氢钠（天津科密欧化学试剂公司）；直投发酵剂YOMIX 883、YO-MIX161、008LYO（美国杜邦公司）；直投式发酵剂YC-X11、LH-B02、L.casei01、YOFLEX Express1.0（丹麦科汉森公司）；直投发酵剂YBS 381（青岛根源生物技术集团有限公司）。

1.2 仪器与设备

TAX-XT2i质构分析仪（英国Stable Micro Systems公司）；iCinac乳品发酵监控仪（法国AMS Alliance公司）；R50A高速乳化剪切机（上海弗鲁克科技发展有限公司）；AH-BASIC高压均质机（加拿大ATS公司）；HWS-24电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 发酵乳的制备

称取45 g脱脂奶粉和55 g全脂奶粉（蛋白含量2.9%），加纯水溶解（55 ℃、30 min），定容至1 000 g，均质（65 ℃、20 MPa），水浴杀菌（95 ℃、5 min），冷却（37～43 ℃）接入发酵剂，发酵至pH 4.6±0.5，于4 ℃后熟24 h后备用。

1.3.2 发酵剂产酸性能测定

将不同发酵剂按1.3.1方法制备发酵乳，于37～43 ℃发酵24 h（以商品发酵剂最适发酵温度计），采用iCinac乳品发酵监控仪测试期间连续pH。

1.3.3 发酵剂产丁二酮含量测定[4-5]

1.3.3.1 丁二酮标准曲线的绘制

取15 μL丁二酮溶于蒸馏水中，定溶至500 mL。分别量取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL丁二酮标准溶液于12支并排放置 的试管中，分别用蒸馏水补足10 mL。向前排 试管中加0.5 mL 1%的邻苯二胺溶液，后排试 管不加邻苯二胺溶液，充分混匀于黑暗处使其反应30 min，加4.0 mol/L盐酸进行终止反应，前排试管加2.0 mL 4.0 mol/L的盐酸，后排试管加2.5 mL，摇匀后用后排试管作为空白对照，用紫外分光光度计在335 nm波长下测定吸光度。以丁二酮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3.2 丁二酮含量的测定

取待测乳样品，与16%三氯乙酸溶液等体积混合，混匀后静置10 min，按3 500g离心10 min后，取上清液，用滤纸将上清液过滤，确保其澄清。取20 mL上清液，等体积分别加入到2个试管中，向1号试管中加0.5 mL 1%邻苯二胺溶液，2号试管不加，充分混匀后于黑暗处使其反应30 min，向2个试管中加入4.0 mol/L的盐酸进行终止反应，1号试管加2.0 mL，2号试管加2.5 mL，混匀后用2号试管作为对照液，用紫外分光光度计在335 nm波长测定吸光度。如果样品中丁二酮含量较高，测得的吸光度超过0.2～1.0的范围，可用8%三氯乙酸对样品进行适当的稀释处理。对照标准曲线计算出样品中丁二酮含量，若样品经稀释，则乘稀释倍数得到丁二酮含量。

1.3.4 发酵剂产乙醛含量测定[6]

取5 mL 1% NaHSO3溶液于250 mL锥形瓶中，加入25 mL处理后上清液，混匀后室温下放置1 h，加入1 mL 1%淀粉溶液，用0.01 mol/L碘液滴定至淡蓝紫色，并且在30 s内淡蓝紫色不褪去，加入20 mL 1 mol/L NaHCO3，充分振荡混匀，用0.01 mol/L碘液滴定至蓝紫色终点，使溶液蓝紫色消失，记录消耗标准碘液的体积，乙醛含量（mg/L）按式（1）计算。

式中：V2为滴定空白消耗碘标准溶液体积，mL；V1为滴定样品消耗碘标准溶液体积，mL；C为碘标准溶液浓度，mol/L；25为样品称样量，mL；0.022为乙醛反应化学基本单位，μg。

1.3.5 发酵剂蛋白水解能力测定

1.3.5.1 酪氨酸标准曲线绘制

配制成10 mmol/L酪氨酸标准溶液。用蒸馏水将该溶液浓度分别稀释为0，2，4，6，8和10 mmol/L的标准溶液。取75 μL上述酪氨酸溶液，加入3 mL的OPA反应液[7]，充分混匀后，室温放置2 min，在340 nm波长下用石英比色杯测定其吸光度。

1.3.5.2 蛋白质水解能力测定[8-9]

取75 μL经三氯乙酸处理过的发酵乳样品加入中试管中，加入3 mL的OPA反应液，混匀后室温放置2 min，在340 nm波长下用分光光度计测定其吸光度。

1.3.6 发酵乳质构特性测试

按1.3.1中方法制备酸乳，采用TAX-XT2i质构分析仪测定产品硬度、稠度、黏聚性。测定条件：选用A/BE探头，压力盘直径35 mm。设置参数：下降速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，提升速度10.0 mm/s，测试深度30 mm，记录整个过程中所需应力。探入过程中的最大峰值为硬度，探头上行的负峰值为黏聚性，曲线正峰面积为稠度。

1.3.7 酸乳总酸度测定

称取10 g酸乳样品置于锥形瓶中，加入20 mL冷却至室温的蒸馏水混匀，加入2滴0.5%的酚酞指示剂，混匀后用氢氧化钠标定溶液滴定至微红色，并在30 s内不褪色，读取消耗氢氧化钠标准溶液体积（V），酸度（°T）按式（2）计算。

式中：C为氢氧化钠标定溶液的摩尔浓度，mol/L。

1.3.8 发酵乳感官评价

将不同发酵剂按1.3.1方法制备发酵乳，于4 ℃后熟24 h后测定酸度，并选择10名具有感官评定经验的食品专业人员进行评分，方法如表1所示。

表1 发酵乳感官评价标准

1.4 数据处理

采用Origin Pro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 发酵剂产酸性能测定结果

由图1可知，不同发酵剂在24 h产酸性能差异显著。发酵剂YO-MIX 883，YC-X11，YO-MIX 161，YBS 381，008LYO和YOFLEX Express1.0产酸趋势基本相同，其中发酵剂YOFLEX Express1.0在6 h使发酵乳降至pH 4.5后仍具有较强产酸性能，24 h使发酵乳降至pH 3.5，而其他5种发酵剂均产酸较快，5～7 h使发酵乳降至pH 4.5左右且后酸化较平缓。

图1 发酵剂产酸性能测试

发酵剂LH-B02，L.casei01产酸速度相对较慢，发酵24 h的发酵乳在pH 4.3左右。

乳酸菌产酸性能是选择发酵剂的主要指标[10]，传统发酵剂是由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌共同组成[11]，在发酵初期嗜热链球菌在乳中快速生产并产生甲酸、丙酮酸和二氧化碳等促进保加利亚乳杆菌生长，保加利亚乳杆菌细胞表面蛋白酶又将酪蛋白分解为短肽和氨基酸进而促进嗜热链球菌生长[12]。Hutkins等[13]研究表明嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌对酸的敏感性不同，pH低于5时，嗜热链球菌生长受到抑制，而保加利亚乳杆菌在pH 3.5时才对酸表现敏感，此外郭清泉等[14]和Beal等[15]研究发现保加利亚乳杆菌是导致后酸化水平较低的主要菌株。试验中供试发酵剂除LH-B02和L.casei01外，其他6种发酵剂均以嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌为优势菌，与上述产酸机理和产酸性能测试结果基本一致。

2.2 不同发酵剂产丁二酮含量测定结果

由图2可知，发酵剂YC-X11，YBS 381产丁二酮能力最强，含量分别为7.37和6.36 μg/mL，其次为发酵剂YO-MIX 161和YOFLEX Express1.0，产丁二酮含量为6.06和5.99 μg/mL。YO-MIX 883，008LYO和L.casei01产丁二酮含量在3.58～5.03 μg/mL之间，而LH-B02产丁二酮能力最弱，为2.55 μg/mL。

图2 发酵剂产丁二酮含量测定结果

丁二酮是酸乳重要的特征风味之一，可赋予酸乳类似坚果的奶油香气，显著改善发酵乳风味[16]。由试验可初步得出，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别作为优势菌群产丁二酮能力较强，均优于干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌，与俞本杰[17]研究结果一致。冷佳[18]研究发现副干酪乳杆菌的产丁二酮能力较强。贺家亮等[19]测得瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌组合产丁二酮含量最多，这主要与不同种属菌株间产香能力具有菌株特异性有关[20]，此外供试发酵剂中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌协同作用可能比单株干酪乳杆菌或瑞士乳杆菌发酵积累更多风味物质[21]。

2.3 不同发酵剂产乙醛含量测定结果

由图3可知：发酵剂LH-B02产乙醛能力最强，含量为24.16 μg/mL；YO-MIX 883和008LYO产乙醛含量最低，仅13.06和14.87 μg/mL；其余5种发酵剂产乙醛能力相差不大，乙醛含量在17.33～21.55 μg/mL之间。

图3 发酵剂产乙醛含量测定结果

乙醛是发酵乳中最具有代表性的风味物质，可赋予酸乳清爽的芳香味，是评价酸乳风味的重要指标[22]。有研究表明糖代谢途径是产生乙醛主要途径，另一种重要合成途径是丙酮酸在α-羧化酶或醛脱氢酶催化下直接生成乙醛，但在嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌中没有检测到上述关键酶[23-24]，因此以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为优势菌的发酵剂产乙醛能力低于瑞士乳杆菌可能与此有关。

2.4 不同发酵剂蛋白水解能力测定结果

由表2可知：发酵剂LH-B02和YOFLEX Express1.0蛋白水解能力最强，游离氨基酸含量分别为4.45和4.20 mmol/L；发酵剂L.casei01水解蛋白能力较强，游离氨基酸含量为3.58 mmol/L；其余5种发酵剂水解蛋白产生游离氨基酸的含量差异不明显，YO-MIX 883蛋白水解能力最弱，游离氨基酸含量为1.97 mmol/L。

表2 不同发酵剂蛋白水解能力测定结果

有研究表明瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌的蛋白水解能力最强，而嗜热链球菌蛋白水解能力一般较低[25]，与发酵剂LH-B02（瑞士乳杆菌）、YOFLEX Express1.0（保加利亚乳杆菌为优势菌）和YO-MIX 883（嗜热链球菌为优势菌）试验结果相同。苏媛宁等[26]研究发现干酪乳杆菌的蛋白水解能力较强，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌则表现较低水平，也与本试验结果一致。此外，吕家平等[27]发现某些嗜热链球菌株的蛋白水解能力较干酪乳杆菌相差并不大，该观点从发酵剂YBS 381测试结果也进行了验证，这可能与菌株特异性有关。

2.5 不同发酵乳质构特性测定结果

由表3可知，不同发酵乳pH在4.60±0.5时，8种发酵剂的发酵乳在硬度、稠度和黏聚性方面差异显著。发酵剂YO-MIX 883，YO-MIX 161和YBS 381在硬度、稠度和黏聚性方面表现突出，其中YO-MIX 883发酵乳的硬度和黏度最高，YBS 381的发酵乳最稠厚，其他5种发酵剂的发酵乳质构特性则相对较小。

表3 不同发酵乳质构特性测定结果

有研究表明发酵乳的硬度、稠度、黏聚性基本呈正向关[8]，菌株产黏性强，发酵乳质构指标相对较高[28]。通常能高产胞外多糖的菌株称为黏性菌株，干酪乳杆菌、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌均能代谢产生胞外多糖，而嗜热链球菌在产胞外多糖方面性质稳定，对提高发酵乳流变性、稳定性、质感和持水性有重要意义[29]，而上述质构表现突出的发酵剂均以嗜热链球菌为优势菌，与之前研究结论相符合。

2.6 不同发酵乳感官评价结果

由表4可知，发酵剂YO-MIX 883、YO-MIX161、008LYO、YC-X11、YBS381的发酵乳感官评分较高，而发酵剂LH-B02、L.casei01、YOFLEX Express1.0的发酵乳感官评价一般，尤其在组织状态和风味方面接受度偏低。

表4 不同发酵剂发酵乳感官评价结果

由2.5小节的结果可知，5种感官评分较高发酵乳的质构指标，尤其黏聚性显著高于其他3种发酵剂。有研究表明发酵乳必须具有较好的入口黏度才能得到消费者较高的评价[30]，与试验结果一致。此外发酵剂LH-B02，L.casei01的发酵乳酸度较高，且黏度较低可能导致酸感在口腔释放度增强，影响口感，掩盖发酵风味；发酵剂YOFLEX Express1.0使感官质量下降原因可能主要与保加利亚乳杆菌在后熟期间酸度增长较快，严重刺激味觉，影响发酵乳品质有关。

3 结论

对市售8种酸乳发酵剂在产酸率、产香能力（丁二酮、乙醛）、蛋白水解能力、质构特性（硬度、稠度、黏聚性）和感官作为评价指标进行发酵特性测试。其中，以嗜热链球菌为优势菌发酵剂（YO-MIX 883、YC-X11、YO-MIX 161、YBS 381、008LYO）产酸较快，5～8 h可使发酵乳降至pH 4.5，后酸平缓，产丁二酮能力最高可达7.37 μg/mL，发酵乳质构特性最高可达硬度139.45 g、稠度3 701.57 g·s、黏聚性-103.78 g，且感官评分都较高。其中，以瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌为优势菌发酵剂（LH-B02、YOFLEX Express1.0）产乙醛和蛋白水解能力较强，含量分别可达24.16 μg/mL和4.45 mmol/L。该试验为提高发酵剂开发不同种类酸乳产品的适宜性、改善酸乳产品质量提供理论依据。