UPLC-Q-TOF-MS法筛查牛乳中48种兽药残留

康俊杰，郑百芹，项爱丽，李爱军，董李学，汤学英

1. 唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2. 河北省农产品质量安全检测技术创新中心（唐山 063000）

原料奶的安全问题，作为生产链的源头面临严峻的挑战，其主要表现是生鲜牛乳中的兽药残留。人类长期进食兽残超标的牛乳，会对身体造成不良影响，同时还会造成人体的耐药性[1-4]。β-受体激动剂一直以来是猪肉中检测的重点参数，但近两年在唐山地区牛肉和牛尿中克伦特罗有检出的现象。GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》和《中华人民共和国农业农村部公告 第250号》对兽药残留也做出了规定，考虑到养殖者用药的不确定性和复杂性，建立一种包括β-受体激动剂的快速测定多种兽残的检测方法刻不容缓。

目前，牛乳中多种兽药的快速检测方法有微生物法[5]、毛细管电泳法[6]、酶联免疫吸附法[7-8]、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法[9-10]、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS法）[11-14]。针对以上问题，试验采用UPLC-Q-TOF-MS快速筛查生鲜牛乳中48种磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、抗病毒类4类兽药残留，该方法具有前处理快速、灵敏度高、回收率稳定等优点，可用于牛奶样品中目标兽药的测定，为牛奶的快速筛查提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

X500R超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（美国SCIEX公司）；高速冷冻离心机（湖南cence湘仪产品）。

乙腈、甲酸、甲醇（均为色谱纯，美国Merck公司）；甲酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）；Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱（美国Waters公司）；十八烷基硅烷（ODS C18，美国Agilent公司）；试验用水为超纯水（Millipore公司）。

标准品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、周效磺胺、磺胺二甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹恶啉、磺胺醋酰、甲氧苄啶、磺胺苯吡唑、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、盐酸地氟沙星、恶唑酸、氟甲喹、沙拉沙星、司帕沙星、丹诺沙星、氟罗沙星、马波沙星、依诺沙星、奥比沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星、西诺沙星、萘啶酸、金刚烷胺、盐酸金刚乙胺、盐酸美金刚、咪喹莫特、盐酸吗啉胍（病毒灵）、奥司他韦、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、氯丙那林、特布他林，纯度均≥98%，天津阿尔塔公司。

1.2 标准溶液配制

分别吸取1 mL上述标准品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成10 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃保存。试验用1∶1甲醇水稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的混合标准使用液，于4 ℃保存。

1.3 样品预处理

取1.00 g生鲜牛乳，加入4 mL 0.2%甲酸乙腈，旋涡振荡1 min，按10 000 r/min高速离心5 min，取上清液过Oasis PRIME HLB固相萃取柱。控制流速在1 s/滴，收集全部流出液，氮气下吹干，用1 mL 5%甲醇水溶液定容，过0.22 μm滤膜后，上机测定。

1.4 色谱-质谱条件

液相色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3（21 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；进样体积10 μL；流速0.300 mL/min；流动相A为水相体积分数0.1%甲酸水，流动相B为有机相10 mmol/L甲酸铵-甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，A为95%；0.5～1.00 min，A由95%线性降至70%；1.00～6.00 min，A由70%线性降至5%；再回到初始状态保持3 min。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子模式（ESI+），扫描范围为m/z80～1 000 Da，毛细管电压5.5 kV；鞘气压力50 psi，气帘气35，温度500 ℃，辅助气压力50 psi，CAD气7；去簇电压80 V，碰撞能量10 V；为了保障质量数精度，用SEIEX公司提供ESI+溶液，对仪器质量轴进行质量校正，参比离子为m/z132.904 88，m/z266.159 81，m/z354.212 24和m/z442.264 67。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

试验选用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，考察了10 mmol/L甲酸铵-甲醇、10 mmol/L甲酸铵-乙腈、0.1%甲酸水、1%甲酸水、乙腈和甲醇6种流动相对48种兽药的分离、离子化效率和峰型的影响。结果表明：当流动相不加酸或酸度较高时，目标化合物的响应值均偏小；当选用0.1%甲酸水时，目标化合物的峰分离较好，响应值增大，峰形好；而不加10 mmol/L甲酸铵的甲醇或乙腈的色谱峰明显提前，分离效果较差。与乙腈相比，甲醇作为流动相可以获得更好的分离度，所以试验水相采用0.1%甲酸水，有机相采用10 mmol/L甲酸铵-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，以实现目标化合物的有效分离。

2.2 质谱条件优化

根据国内近3年在牛肉、牛尿和牛奶样品中兽药残留的检出情况，最终确定48种常用兽药。将目标化合物配制成质量浓度为100 ng/mL的混合标准溶液。应用超高效液相色谱仪进行色谱分离，Q-TOF进行质谱信息采集，在ESI+模式下，在m/z80～1 000范围内作一级质谱全扫描分析，再在不同的碰撞电压下，进行二级质谱扫描分析，收集48种目标化合物的保留时间、母离子精确分子质量等信息，以建立完整的48种兽药的质谱筛查谱库。谱库中应包含化合物的名称、保留时间等，具体分析参数见表1。试验再通过比较各化合物的离子色谱峰的响应值和分离度，分别优化毛细管电压、鞘气压力等质谱参数，48种兽药的提取离子色谱图见图1，以磺胺噻唑为例，其一级质谱图和二级质谱图见图2和图3。

图1 48种兽药的混合标准溶液的总离子流色谱图（正离子）

图3 磺胺噻唑质谱扫描图

表1 48种兽药的质谱分析参数

2.3 样品前处理方法的选择

试验比较不同提取溶剂，提取目标化合物，同时沉淀蛋白。试验选择体积分数1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、乙腈作为3种提取液。试验表明当采用0.2%甲酸乙腈提取效果最好，酸化后乙腈的提取效果明显高于纯乙腈，但甲酸的体积分数太高，对碱性化合物回收率影响较大。因此试验最终选择0.2%甲酸乙腈作为提取溶剂，与文献[15]研究结果一致。48种兽药化合物的回收率均在60%～120%之间，能满足快速筛查试验的基本要求。

试验选取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB和C18这3种固相萃取柱进行比较试验。结果表明，与Oasis HLB和C18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基质干扰，基质抑制改善明显，目标化合物均有较高的回收率。同时试验了Oasis PRIME HLB柱无活化和平衡过程，采用直接上样品净化方式，对目标化合物进行处理，结果表明，此固相萃取柱活化平衡步骤对此次试验的化合物回收率影响不大，故选用Oasis PRIME HLB小柱进行净化，以达到样品中目标化合物快速筛查的目的。

2.4 方法学确证

2.4.1 标准曲线和定量限

取空白生鲜牛乳样品，根据目标化合物在质谱中响应的强弱，加入不同浓度的混合标准溶液，按试验方法进行样品的预处理，对提取液中的目标化合物进行测定，以化合物的离子峰面积Y对其相应质量浓度X（μg/kg）做标准曲线，48种兽药的线性范围等见表2。各目标化合物的信噪比为10（S/N=10）的浓度，为其定量限（LOQ）。由图2可看出，在10～500 μg/kg线性范围内相关系数均大于0.99。查看牛奶中最大残留限量（MRL）数值，该方法的LOQ数值小于MRL，能满足快速筛查的试验要求。

图2 磺胺噻唑提取离子色谱图

2.4.2 回收率和精密度

向空白牛乳中添加3个不同质量分数水平（10，20和50 μg/kg）的48种混合标准溶液，按1.3小节的方法进行提取，用UPLC-Q-TOF进行测定目标化合物。每一个添加浓度重复测定6次进行试验，计算平均回收率和相对标准偏差（SRSD）。牛乳中48种兽药的加标回收率为68.4%～118.2%，SRSD为3.1%～29.8%。

2.5 样品分析

按试验方法对唐山地区奶牛场现场采集到的50批生鲜牛乳样品进行筛查检测分析。结果测出一批牛乳样品中磺胺间甲氧嘧啶有检出，质量分数为85.4 μg/kg。为了验证该结果，分别采用GB/T 21316—2017和GB/T 22966—2008液相质谱法进行验证，检测结果分别为83.9和81.6 μg/kg，3种试验方法的检测结果标准偏差在允许范围内，进一步确证了该方法对牛乳样品快速筛查结果的准确性。

3 结论

该验建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定生鲜牛乳样品中48种禁用和限用兽药残留的快速筛查方法。该方法前处理过程简单、快速、通量大、准确性高。UPLC-Q-TOF质谱法在牛乳中兽药残留快速筛查检测方面有明显优势，可一次分析出数百种不同目标化合物，在兽药残留筛查领域有很高研究价值。