miR⁃496靶向调控DCUN1D1抑制宫颈癌发生发展机制研究

方艳惠 康晓丽 朱巧英 刘婷 刘胜冬

河北医科大学第四医院妇科（石家庄050011）

宫颈癌（cervical cancer，CC）是全球四大女性恶性肿瘤之一，每年新增病例数逾50 万［1⁃2］。随着宫颈癌早期筛查技术的发展［3］以及HPV 疫苗的临床应用，发病率有所降低［4⁃5］。但其预后较差主要是由于局部浸润和远端转移，因此研究宫颈癌分子机制对改善其预后不良有重要意义［6］。

研究表明miRNA与肿瘤的发生发展密切相关，其中miR⁃21、miR⁃34［7］、miR⁃187［8］、miR⁃221［9］等多种miRNAs 已证实与宫颈癌机制有关，本团队曾发现在宫颈癌中，miR⁃496 通过调控SFMBT1 抑制子宫颈癌HeLa 细胞增殖、迁移和侵袭［10］，但miRNA与靶基因形成复杂的调控网络参与癌症的发展，本研究将进一步探究miR⁃496 以及其潜在靶点在宫颈癌发生发展的机制研究。前期通过生信软件预测发现，重组人缺陷于清选蛋白neddylation蛋白1 域含1（DCUN1D1）是miR⁃496 潜在靶基因，DCUN1D1 作为一种致癌基因，已证实在包括宫颈癌在内的多种癌症中异常高表达，并与肿瘤的恶性进展和不良预后有关［11-12］。因此本研究旨在观察miR⁃496 与DCUN1D1 在宫颈癌中的作用及工作机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂宫颈癌肿瘤标本和癌旁正常组织标本来自本院78 例接受手术的宫颈癌患者，所涉及标本患者均签署知情同意书，并获得本院伦理委员会批准。Hela 细胞购买自购于中国科学院上海细胞库，RPMI 1640 培养基购买自Gibco 公司，TRIzol、逆转录试剂盒以及转染试剂LipofectamineTM2000 购自美国Thermo 公司，Transwell 小室、Matrigel 胶购自美国Corning 公司，抗体购买自Abcam 公司，miR⁃496 mimics 和阴性对照由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2 免疫荧光实验检测蛋白表达将组织切片脱蜡入水，微波加热法修复抗原，（94 ℃，10～15 min），加入5%的正常羊血清封闭，37 ℃，60 min。滴加1∶500 比例稀释的DCUN1D1 抗体，4 ℃过夜。滴加荧光素标记的二抗，37 ℃，60 min。弃二抗，4 ℃避光，荧光显微镜观察拍照。

1.3 细胞培养和转染HeLa 细胞株使用含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 作为细胞培养液，置于37 ℃含95%空气和5% CO2的细胞培养箱中培养。将HeLa 细胞株分为对照组，miR⁃496 组和miR⁃496+DCUN1D1组，待细胞生长融合度至70%～90%时，按照转染试剂LipofectamineTM2000 说明书对细胞分别转染。

1.4 双荧光素酶报告基因实验利用microRNA靶基因数据库预测miR⁃496 与DCUN1D1 可能的作用位点。构建DCUN1D1 野生型3′⁃UTR 荧光素梅质粒pMIR⁃WT 和突变型质粒pMIR⁃Mut。将pMIR⁃WT、pMIR⁃Mut 与PTEN mimics 和negative control miRNA mimics 共转染进HeLa 细胞，转染24 h 后，每孔加入100 μL 被动裂解液，使用酶标仪配套软件进行结果分析。

1.5 qRT⁃PCR 检测mRNA 表达按照Trizol 试剂盒步骤提取总RNA，按照反转录试剂盒，将总RNA进行RNA 逆转录，合成cDNA。按照qRT⁃PCR 试剂盒说明书进行PCR 反应，qRT⁃PCR 结果以CT 值形式表示。

1.6 Western blot检测蛋白表达采用RIPA裂解缓冲液提取细胞或组织蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，取上样缓冲液与样品混合并置于95℃变性10 min。电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。将使用抗体稀释液以1∶500 比例稀释的DCUN1D1抗体和1∶1 000 稀释的GAPDH 抗体加入至PVDF膜，GAPDH 为内参。4 ℃过夜。加入1∶1 000 稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h。等体积混合ECL 发光液A、B 液，滴加至PVDF 膜，放入成像系统曝光。

1.7 CCK8 实验检测宫颈癌HeLa 细胞增殖能力各组HeLa 细胞以2 000 个/孔的量接种细胞到96 孔板，每孔200 μL 细胞悬液。细胞在转染72 h后，按照CCK⁃8试剂盒操作说明书于每孔加入10 μL CCK⁃8 溶液，于37 ℃培养箱中孵育1 h，在450 nm波长下测定吸光度。

1.8 Transwell 实验检测宫颈癌HeLa 细胞迁移、侵袭能力迁移实验：各组HeLa 细胞细胞密度为1 × 106个/mL，然后将200 μL 的细胞悬液接种于Transwell 小室中，在24 孔板内与小室的间隙中加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养液，培养18～24 h。取出Transwell 小室，用PBS 缓冲液擦掉滤膜上层细胞，固定10 min，放入0.5%结晶紫染色液中（10 min），在显微镜下观察滤膜下层细胞。侵袭实验：将-20 ℃保存的Matrigel 置4 ℃冰箱18～24 h，次日将50 μL 稀释好的Matrigel（1∶9）均匀铺于Transwell 底部（37 ℃，3 h），其余步骤与Transwell迁移实验相同。

1.9 构建宫颈癌裸鼠移植瘤模型选取BALB/c裸鼠12 只，6～ 8 周，体质量19～ 23 g，所有裸鼠随机分为对照组（6 只）和miR⁃496 组（6 只）。HeLa 细胞转染后，用1 mL 注射器将细胞悬液注射到裸鼠的右后肢腋部皮下，每只裸鼠接种细胞数为1 ×107个/只。随后将裸鼠置于SPF 级动物实验室饲养。21 d 处死裸鼠，肿瘤组织称重、固定。

1.10 统计学方法采用SPSS Statistics 22.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织中DCUN1D1和miR⁃496的表达免疫荧光和Western blot 检测结果显示DCUN1D1蛋白在宫颈癌组织表达明显高于癌旁正常组织（P< 0.01，图1A、C）。qRT⁃PCR 结果显示宫颈癌组织中DCUN1D1 的mRNA 表达明显升高，而miR⁃496 表达显著降低（P<0.01，图1B、D）。

图1 宫颈癌组织中DCUN1D1 的表达Fig.1 Expression of DCUN1D1 in cervical cancer tissue

2.2 不同分期宫颈癌组织中miR⁃496、DCUN1D1的mRNA 表达水平qRT⁃PCR 结果显示，宫颈癌的临床分期越高，DCUN1D1 的mRNA 表达水平越高，miR⁃496 表达水平越低（P<0.01，图2）。

图2 不同分期宫颈癌组织中miR⁃496、DCUN1D1 的mRNA 表达Fig.2 Expression of miR⁃496 and DCUN1D1 in cervical cancer tissue of different stages

2.3 DCUN1D1 是miR⁃496 靶基因采用Target Scan 筛选miR⁃496 的潜在靶基因发现DCUN1D1 的3′⁃UTR上具有潜在的结合位点与miR⁃496形成互补结合（图3A）。双荧光素酶报告基因试验显示转染pMIR⁃DCUN1D1⁃wt 质粒miR⁃496 组荧光素酶活性明显降低，转染pMIR⁃DCUN1D1⁃Mut 质粒miR⁃496组荧光素酶活性无明显影响（P<0.01，图3B）。miR⁃496 mimics 转染进HeLa 细胞后，细胞中miR⁃496的表达水平较对照组明显升高（P< 0.01，图4A），qRT⁃PCR 和Western blot 结果显示，相比对照组，miR⁃496 组的细胞中DCUN1D1 的mRNA 和蛋白表达均明显降低（P<0.01，图4B、C）。

图3 预测并验证DCUN1D1 是miR⁃496 靶基因Fig.3 DCUN1D1 is the target gene of miR⁃496

图4 miR⁃496 负调控DCUN1D1 表达Fig.4 miR⁃496 negatively regulates the expression of DCUN1D1

2.4 miR⁃496 和DCUN1D1 对HeLa 细胞生物功能的调控CCK8 法结果示，相比对照组，miR⁃496 mimics 组中OD值明显降低，但miR⁃496+DCUN1D1组的OD值明显高于miR⁃496 mimics 组（P< 0.01，图5A）。Transwell 实验结果显示，相比对照组，miR⁃496 组迁移和侵袭细胞计数均明显降低，但相比miR⁃496 组，miR⁃496+DCUN1D1 组细胞的迁移和侵袭能力增强（P<0.01，图5B）。

图5 miR⁃496 和DCUN1D1 对宫颈癌HeLa 细胞生物功能的调控Fig.5 Regulation of miR⁃496 and DCUN1D1 on the biological function of cervical cancer HeLa cells

2.5 宫颈癌裸鼠移植瘤模型以及DCUN1D1 表达21 d 后宫颈癌移植瘤模型结果示，miR⁃496 组裸鼠中移植瘤体积和重量明显低于对照组（P<0.01，图6A、B）。免疫荧光结果显示，miR⁃496 组裸鼠中DCUN1D1 和Ki67 阳性信号均明显低于对照组（P<0.01，图6C）。

图6 miR⁃496 在宫颈癌裸鼠移植瘤模型表达Fig.6 Expression of miR⁃496 in xenograft model of cervical cancer in nude mice

3 讨论

在各种癌症的发生发展中，miRNA作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥着重要作用［13-15］。研究显示，miR⁃496 与多种癌症发病机制相关，ALQURASHI等［16］研究发现，miR⁃496 在内的5 种miRNAs 在结直肠癌中表达下调。MA 等［17］发现在非小细胞肺癌中，miR⁃496 通过靶向BDNF 介导的PI3K/Akt 信号通路抑制肿瘤发生。WANG 等［18］发现，miR⁃496通过靶向RASSF6 促进大肠癌细胞的迁移和上皮⁃间质转化。本研究中通过构建宫颈癌裸鼠移植瘤模型发现，miR⁃496 过表达的裸鼠中移植瘤体积和重量明显低于对照组，表明miR⁃496 抑制了裸鼠瘤体的生长，提示miR⁃496 可能具有抑制宫颈癌的功能。

miRNA 通过抑制目标mRNA 和翻译来调节基因表达，从而参与多种生物学过程。本研究利用TargetScan 发现miR⁃496 在DCUN1D1 的3′⁃UTR 上具有潜在的结合位点，表明DCUN1D1 是其潜在靶基因。进一步通过双荧光素酶报告基因试验发现miR⁃496 的确能与DCUN1D1 的3′⁃UTR 特异性结合并抑制其表达。

DCUN1D1 被称为鳞状细胞癌相关癌基因，研究显示DCUN1D1 在癌症中具有致癌活性［19］。SHUANG等［20］研究发现，DCUN1D1在喉鳞状细胞癌组织中的表达升高，miR⁃195可通过靶向DCUN1D1抑制喉鳞状细胞细胞的生长和侵袭。JIANG 等［21］发现DCUN1D1 在宫颈癌组织中较癌旁组织表达上调，且其高表达与宫颈癌患者淋巴结转移、临床分期、生存时间缩短有关。结果与以往研究类似，本研究通过免疫荧光等实验发现DCUN1D1在宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，通过比较不同分期宫颈癌组织中miR⁃496、DCUN1D1 的表达水平发现，宫颈癌组织的临床分期越高，DCUN1D1 的mRNA 表达水平越高，miR⁃496 的表达水平越低。由此可以推测，DCUN1D1的过表达能够促进肿瘤细胞的转移，增强肿瘤细胞的局部侵袭，促进恶性肿瘤的进展。

为了探究miR⁃496 与DCUN1D1 在宫颈癌肿瘤转移的调控机制，本研究中通过体外实验深入探究了miR⁃496 与DCUN1D1 对宫颈癌细胞HeLa 生物学行为的影响。实验结果显示，转染miR⁃496 mimics 能抑制HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，但在细胞中同时高表达DCUN1D1 则能逆转miR⁃496 的这种抑制效果，表明miR⁃496 是通过调控DCUN1D1 从而抑制宫颈癌细胞的生物学行为。

综上所述，本研究发现miR⁃496 的低表达与宫颈癌可能密切相关，进一步miR⁃496 可通过靶向调控DCUN1D1 抑制宫颈癌发生发展，miR⁃496 有望成为宫颈癌靶向治疗的一个靶点。