HPLC-DAD法同时测定复方甘草片中3种有效成分和5种防腐剂

张 筱， 隋海山*， 李现菊， 杨丽蓉， 齐衍超， 张秀霞

(1.潍坊市检验检测中心，山东 潍坊 261000；2.高密市人民医院，山东 高密 261500)

复方甘草片为多组分组成的中药复方制剂，方中甘草浸膏为保护性镇咳祛痰剂[1-3]，主要成分甘草皂苷、甘草黄酮活性较强，其中皂苷类成分甘草酸、甘草次酸在甘草中含量较高，超过2%，而黄酮类成分甘草苷具有抗溃疡、抗菌、抗炎、镇痛等作用[4-5]。2020年版《中国药典》二部[6]收载了复方甘草片中甘草酸的含量测定，但未对其他有效成分进行控制，而且流动相系统含盐量高，色谱柱损耗快。另外，现行标准未对复方甘草片中苯甲酸钠的添加量进行控制，存在滥用防腐剂等风险。

近几年来，复方甘草片中多种有效成分的含量测定多有报道[7-16]，但鲜有同时测定防腐剂含量的研究。因此，本实验建立HPLC-DAD法同时测定复方甘草片中有效成分甘草酸、甘草苷、甘草次酸，以及防腐剂苯甲酸钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1260Ⅱ高效液相色谱仪，配置四元泵、在线脱气机、自动进样器、DAD检测器、Open LAB CDS 2.X化学工作站(美国Agilent公司)；XSE205DU电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；超声仪。甘草酸铵(批号110731-202021，纯度96.2%)、苯甲酸钠(批号100433-201702，纯度99.7%)、甘草苷(批号111610-201907, 纯度93%)、甘草次酸(批号110723-201715, 纯度99.6%)、羟苯甲酯(批号100278-201705，纯度100%)、羟苯乙酯(批号100847-201604，纯度99.9%)、羟苯丙酯(批号100444-201804，纯度99.60%)、羟苯丁酯(批号190010-201001，纯度99.70%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。复方甘草片共10批(批号1903004、171134、171128、1802001、180509、1903015、1803014、1811029、1903019、1810007)，来源于山东省市场监督管理局抽样。甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，50%甲醇溶解，稀释成每1 mL分别含甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯1.5、0.4、0.2、0.04、0.05、0.05、0.05、0.04 mg的溶液(1)。另取上述各对照品适量，同法制成每1 mL分别含上述成分2.5、0.5、0.15、0.05、0.05、0.05、0.05 g、0.04 mg的溶液(2)。

2.1.2 供试品溶液 取本品10片，研细，精密称取适量(约1片量)，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇超声提取30 min，放冷，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例,制备缺甘草浸膏粉、苯甲酸钠的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长240 nm(检测苯甲酸钠、甘草苷)、254 nm(甘草酸、甘草次酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯)；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.3 专属性试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品(1)(稀释10倍)、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分理论塔板数均大于3 000，与相邻峰的分离度均大于1.5，杂质对被测成分无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液(1)0.2、0.5、1.0、2.5、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成6个质量浓度，在“2.2”项色谱条件下各进样测定2次。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，另外羟苯类防腐剂作为处方外非法添加成分筛查的目标物，需对方法检出限和定量限作进一步考察，故取本品(不含羟苯类防腐剂)作为空白基质，进行低质量浓度水平添加后逐级稀释，以信噪比(S/N)为3计算检出限(LOD)，为10计算定量限(LOQ)，结果见表2，可知各有效成分及防腐剂在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液(1)适量，50%甲醇稀释10倍，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯峰面积RSD分别为0.8%、0.6%、1.2%、1.8%、0.9%、1.5%、1.4%、0.9%，相对保留时间RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

1.苯甲酸钠 2.甘草苷 3.羟苯甲酯 4.甘草酸 5.羟苯乙酯 6.羟苯丙酯 7.羟苯丁酯 8.甘草次酸1.sodium benzoate 2. liquiritin 3. methyl hydroxybenzoate 4. glycyrrhizic acid 5. ethyl hydroxybenzoate6. propyl hydroxybenzoate 7. butyl hydroxybenzoate 8. glycyrrhetinic acid图1 各有效成分、防腐剂HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various effective constituents and preservatives

表2 各有效成分、防腐剂线性关系

2.6 重复性试验 取本品(批号1903015)细粉6份，每份各约0.15 g(约1片量)，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸含量RSD分别为1.0%、0.8%、1.3%、1.8%，而羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯均未检出，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、12、24 h在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯峰面积RSD分别为0.8%、0.9%、1.2%、2.0%、1.8%、 1.4%、0.6%、0.9%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 称取各成分含量已知(甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸分别为10.1、1.99、0.65、0.23 mg/片，均不含羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯)的本品(批号1903004)细粉6份，每份各约0.5片量，精密称定，置于50 mL量瓶中，精密加入“2.1.1”项下对照品溶液(2)2 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘草酸、苯甲酸钠、甘草苷、甘草次酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯平均加样回收率分别为99.1%、95.4%、98.9%、99.6%、98.4%、100.5%、100.0%、96.5%，RSD分别为2.0%、1.2%、2.0%、2.3%、2.0%、1.9%、1.7%、1.6%。

2.9 样品含量测定 取本品10批，按“2.1.2”项下方法各平行制备3份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表3，可知各防腐剂均未被检测出。

表3 各有效成分、防腐剂含量测定结果(mg/片，n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件筛选 本实验对Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Shim-pack GIST C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse pluss C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行考察，发现Shim-pack GIST C18色谱柱对各成分的分离效果最佳。同时，选择磷酸二氢钾溶液-乙腈作为流动相，并考察了在不同体积分数磷酸二氢钾溶液、不同比例流动相下的分离效果，最终采用“2.2”项下色谱条件进行梯度洗脱。

3.2 检测波长筛选 本实验采用DAD检测器进行全波长扫描，发现苯甲酸钠、甘草苷分别在226、270 nm处有最大吸收，并且两者在240 nm附近均有较强吸收，同时羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯在256 nm处有最大吸收，甘草酸、甘草次酸在250 nm处有最大吸收。为了使各成分在一次进样中同时测定，本实验设定240、254 nm检测通道，其中苯甲酸钠、甘草苷选择前者，其他6种成分选择后者。

4 结论

本实验建立HPLC-DAD法同时测定复方甘草片中有效成分甘草酸、甘草苷、甘草次酸，以及防腐剂羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的含量，该方法准确可靠，可用于该制剂的质量控制。