蒜酶对同型半胱氨酸的催化裂解作用

哈米旦木·艾合买提江， 张婷婷， 任 锐， 敬 爽， 摆富叶， 李新霞，2*， 王 艳，2*

(1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)

同型半胱氨酸(Hcy)又称为高半胱氨酸，是体内蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物[1]，它是含硫氨基酸，血浆中存在2种形式，一种是还原型([H]-Hcy)，结构中含有巯基；另一种是氧化型([O]-Hcy)，其结构是还原型以二硫键所形成的，当血浆中其水平高于15 μmol/L时，即可诊断为高同型半胱氨酸血症[2]。研究表明，高水平Hcy能够通过各种途径直接或间接的造成血管内皮细胞损伤，增强血小板功能活性，促使血栓形成，影响低密度脂蛋白的氧化过程，诱导和促进血管平滑肌细胞增殖[3]，现已被公认为是心脑血管疾病的独立危险因素之一[4-5]，并寻找降低体内其水平的潜在药物对心血管系统疾病的诊断与防治具有重要意义。

大蒜及其制品在医药和保健品方面已得到普遍认可，具有降血脂、预防动脉粥样硬化、抗血小板聚集等多种药理作用[6-8]，在防治高同型半胱氨酸血症并冠心病、脑梗死等方面的临床及实验研究已有报道[9-10]。蒜酶又称蒜氨酸裂解酶，是二聚体糖蛋白[11]，也是存在于大蒜中的内源酶，能裂解蒜氨酸C-S键，生成大蒜辣素和系列含硫化合物，从而表现出大蒜特性[11]，其适宜底物为S-烷基-L-半胱氨酸亚砜类化合物，Hcy结构与蒜酶的天然底物蒜氨酸结构相似，后者是否可通过催化裂解作用来降低前者水平值得探讨。本实验通过测定Hcy减少量，来探索蒜酶对其催化裂解作用。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(型号LC-20AD-SPD-RID，日本岛津公司)；紫外分光光度计(型号UV-2550，日本岛津公司)；低温高速离心机(型号MULTIFUGE X3R，美国赛默飞世尔公司)；分析天平(型号AB153-S，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试剂与药物 [H]-Hcy(纯度≥98%，美国 Sigma Aldrich公司)；[O]-Hcy(纯度≥90%，上海源叶生物科技有限公司)；三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(SBD-F)(美国Sigma Aldrich公司)。蒜酶(新疆埃乐欣药业有限公司，批号201801001)。甲醇为色谱纯；磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、四硼酸钠、乙二胺四乙酰二钠、三氟乙酸、冰乙酸、结晶乙酸钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 [H]-Hcy对照品溶液 精密称取[H]-Hcy对照品15 mg，置于50 mL量瓶中，磷酸盐缓冲液溶解定容，即得(浓度为2 000 μmol/L)，使用时用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。

2.1.2 [O]-Hcy试剂溶液 精密称取[O]-Hcy 27 mg，置于100 mL量瓶中，磷酸盐缓冲液溶解，即得(浓度为1 000 μmol/L)。

2.1.3 蒜酶溶液 精密称取蒜酶适量，置于量瓶中，pH 7.0磷酸盐缓冲液涡旋溶解，摇匀，即得。

2.2 [O]-Hcy还原反应条件筛选 参考文献[12-13]报道，固定还原温度、还原时间分别为37 ℃、10 min。

2.2.1 吸收波长 精密量取[H]-Hcy对照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加pH 5.5磷酸盐定容，在200～800 nm波长范围内进行紫外光谱扫描。结果，Hcy在206 nm处有最大吸收，但该处属于末端吸收，故确定210 nm作为检测波长。

2.2.2 色谱条件 XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.04%三氟乙酸；体积流量0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。色谱图见图1。

注：A为[H]-Hcy，B为[O]-Hcy还原后。图1 [O]-Hcy还原后HPLC色谱图

2.2.3 还原剂用量 取10 mmol/L[O]-Hcy溶液2 mL，分别加入比例为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶12的100 mmol/L TCEP还原剂，37 ℃水浴反应10 min，反应液过0.22 μm微孔滤膜，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定。结果，[H]-Hcy峰面积随着还原剂剂量与[O]-Hcy比例增加升高，达到1∶8后不再变化，故确定两者比例为1∶8。

2.3 [H]-Hcy衍生化反应条件选择

2.3.1 检测波长 精密量取1 mmol/L[H]-Hcy 1 mL，加不同比例SBD-F溶液，70 ℃水浴反应60 min后立刻放入冰水浴中冷却10 min，定容至10 mL，扫描紫外吸收光谱，发现最大吸收波长为384 nm。

2.3.2 色谱条件 XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相pH 4.5醋酸盐缓冲液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～16 min，2%～5%B)；体积流量0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长384 nm；进样量20 μL。色谱图见图2。

注：A为[H]-Hcy衍生化后，B为[O]-Hcy衍生化后。图2 [H]-Hcy、[O]-Hcy衍生化后HPLC色谱图

2.3.3 衍生剂用量 取0.2 mmol/L[H]-Hcy 1 mL，分别加入比例为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的SBD-F衍生化溶液，70 ℃水浴反应60 min后冷却10 min，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定。结果，当[H]-Hcy与SBD-F比例为1∶2时衍生化反应可达到完全，故确定两者比例为1∶2。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 将[H]-Hcy对照品用磷酸盐缓冲液溶解，摇匀定容，得320 μmol/L 贮备液，磷酸盐缓冲液稀释至10、20、40、80、160 μmol/L，分别量取适量，加入SBD-F工作液，70 ℃水浴反应60 min后冷却10 min，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定。以衍生化[H]-Hcy浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行测定，得方程为Y=6 034.9X-73 769(r=0.999 0)，在10～160 μmol/L范围内线性关系良好。同时，检测限为10 μmol/L。

2.4.2 精密度试验 制备[H]-Hcy对照品溶液，同一天在“2.3.2”项色谱条件下进样测定5次，计算日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度，测得两者RSD分别为0.59%、0.83%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 制备6份[H]-Hcy对照品溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，测得峰面积RSD为0.9%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取[H]-Hcy对照品溶液适量，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，测得峰面积RSD为1.39%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取低、中、高浓度标准溶液各3份，加样后在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 [H]-Hcy加样回收率试验结果(n=3)

2.5 蒜酶对Hcy的催化裂解作用 分别取1 mmol/L[O]-Hcy溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL，加入蒜酶溶液0.4 mL，35 ℃水浴反应10 min，分别加入TCEP溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL，37 ℃水浴反应10 min，分别加入SBD-F贮备液0.12、0.24、0.36、0.48、0.60、0.72 mL，70 ℃水浴反应60 min后冷却10 min，作为供试品溶液；另以磷酸盐缓冲液替代蒜酶溶液加入反应体系，作为空白对照溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，结果见表2。由此可知，蒜酶可使[H]-Hcy含量在反应后有所降低，即对后者有一定的催化裂解作用。

表2 蒜酶对[O]-Hcy溶液中Hcy的催化裂解作用(n=3)

取大鼠血浆90 μL，置于EP管中，加入[O]-Hcy 10 μL、0.6 mol/L高氯酸100 μL，14 000 r/min离心10 min，吸取上清液100 μL，加入蒜酶400 μL，35 ℃水浴反应10 min，加入TCEP溶液30 μL，37 ℃水浴反应10 min，加入SBD-F贮备液430 μL，70 ℃水浴反应60 min后冷却10 min，作为供试品溶液；另以磷酸盐缓冲液代替蒜酶溶液加入反应体系，作为空白对照溶液，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，结果见表3。由此可知，蒜酶也可催化裂解大鼠血浆中的[O]-Hcy，转化率可达到50%。

2.6 蒜酶/Hcy催化动力学研究

2.6.1 反应时间对酶促反应的影响 精密量取蒜酶溶液0.4 mL，精密加入1 000 μmol/L[O]-Hcy溶液0.1 mL，35 ℃水浴反应5、10、15 min，按“2.5.1”项下方法处理，微孔滤膜过滤，取20 μL，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算[H]-Hcy含量，结果见表4。由此可知，随着反应时间延长，转化率无明显变化，故选择反应时间为10 min。

表3 蒜酶对大鼠血浆中Hcy的催化裂解作用(n=3)

表4 反应时间对酶促反应的影响(n=3)

2.6.2 [O]-Hcy与蒜酶比例对转化率的影响 精密量取[O]-Hcy 0.1 mL、不同浓度蒜酶溶液0.4 mL，35 ℃水浴反应10 min，按“2.5.1”项下方法处理，微孔滤膜过滤，取20 μL，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算[H]-Hcy含量，结果见表5。由此可知，[O]-Hcy与蒜酶比例为1∶6.0(即6.0 U蒜酶可催化裂解1 μg[O]-Hcy)时，转化率可达到80%以上。

表5 [O]-Hcy与蒜酶比例对转化率的影响(n=3)

2.6.3 底物浓度对酶促反应初速度的影响 精密量取蒜酶溶液0.4 mL，精密加入不同浓度[O]-Hcy溶液各0.1 mL，35 ℃水浴反应10 min，按“2.5.1”项下方法处理，微孔滤膜过滤，取20 μL，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定；另取[H]-Hcy对照品溶液，同法处理，在“2.3.2”项色谱条件下进样测定，计算含量，测定反应速度，以反应速度V对相应底物浓度作图，在直线范围内作趋势线，其斜率即为酶促反应的初速度(V0)，结果见图3～4。由此可知，当磷酸盐缓冲液pH为5.5时，在0～129.25 μmol/L范围内V0为0.09 μmol/(L·min)；pH为5.5时，在0～64.78 μmo/L范围内V0也为0.09 μmol/(L·min)。

图3 底物浓度对酶促反应速度的影响(pH 5.5)

图4 底物浓度对酶促反应速度的影响(pH 6.8)

2.6.4 动力学常数测定 以反应速度倒数为纵坐标(Y)，[H]-Hcy浓度倒数为横坐标(X)，采用双倒数作图法作图。结果，当磷酸盐缓冲液pH为5.5时，Km为4 710 μmol/L，Vmax为384.62 μmol/(L·min)，回归方程为Y=12.248X-0.002 6 (r=0.999 7)；pH为6.8时，Km为316.78 μmol/L，Vmax为22.03 μmol/(L·min)，回归方程为Y=14.382X-0.045 4 (r=0.999 4)。

3 讨论

研究蒜酶对Hcy催化裂解作用的前提是建立准确、可靠和简便的检测方法，目前有气相色谱质谱联用法、化学发光免疫法、HPLC法等[14-16]，其中最常用的是HPLC法。由于血浆中Hcy的存在形式有氧化型、还原型及其蛋白结合物等，故其HPLC法测定的都是总Hcy，首先加入还原剂使[O]-Hcy都转换成[H]-Hcy，然后用巯基衍生剂进行柱前衍生化，最后采用荧光检测器进行检测[17]。本研究在参考相关文献的基础上，考虑到紫外检测器应用广泛、线性范围和检测灵敏度较高等优点，将Hcy还原、柱前衍生后采用紫外检测器检测，建立了Hcy的HPLC紫外检测方法。另外，血浆样品处理复杂，存在很多干扰因素，不利于快速筛选和研究蒜酶对Hcy的催化裂解作用，故又建立了体外筛选Hcy的体系和检测方法，人体血浆中99%为[O]-Hcy，购买的Hcy试剂即为[O]-Hcy，可实现这一体系。另外，Hcy对照品为[H]-Hcy，以其制作标准曲线后作为衍生化反应的反应物对样品的前处理条件(还原反应及衍生化反应)进行考察。为了更好地考察还原反应和衍生化反应，2个反应分别采用了2种色谱条件，均能实现待测物与反应液中各成分的分离，该方法与血浆中Hcy的分析方法类似，但省去了血浆样品前处理的繁琐步骤，准确灵敏，快速简便，可作为体外筛选和评价预防和治疗高同型半胱氨酸药物的手段。

Hcy升高作为心脑血管疾病的危险因素，正日益受到学者们的重视。本实验依据Hcy是氨基酸半胱氨酸的异种，其结构与蒜酶最适底物蒜氨酸的结构具有相似性，探索蒜酶对同型半胱氨酸是否具有催化裂解作用，以已建立的[H]-Hcy的HPLC分析方法测定蒜酶与不同浓度[O]-Hcy反应前后[H]-Hcy的含量变化，发现该酶类具有一定的催化裂解作用，可使后者转化率达80%以上。另外，Hcy易溶于酸性溶液，故本实验首先用pH 5.5磷酸盐缓冲液研究体外蒜酶对Hcy的催化动力学，测得其Km为4 710 μmol/L。人体体液pH约在7左右，为了更接近该数值，本实验选择pH 6.8磷酸缓冲盐研究蒜酶对Hcy的催化动力学，测得其Km为316.78 μmol/L，小于pH 5.5下的Km值，表明蒜酶与[O]-Hcy的亲和力较好。

4 结论

本实验建立了Hcy的HPLC紫外检测方法，通过测定其减少量来探索蒜酶对同型半胱氨酸是否具有催化裂解作用，可为寻找降低体内Hcy的潜在药物在心血管系统疾病诊断与防治中的应用提供参考。