育苗温室辣根素消毒处理效果研究

赵立群，田 文，田雅楠，曹玲玲，徐秀兰

（1北京市农业技术推广站，北京 100029；2中国农业大学植物病理系，北京 100093；3北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部北京蔬菜种子质量监督检验测试中心，北京 100097）

0 引言

种苗生产集约化是蔬菜生产现代化的第一要素。中国每年育苗移栽蔬菜的种苗需求量约为6800亿～7300亿株，目前全国的集约化育苗量仅有1000亿株，发展潜力及势头仍十分迅猛[1]。北方地区一般利用日光温室进行蔬菜集约化育苗生产，可以在设施内进行有效的环境调控，保证幼苗生长所需环境条件[2]。规模化集约化育苗场年育苗量一般在500万株以上，包括番茄、黄瓜、辣椒、茄子、西瓜、花椰菜、芹菜等多个品种[3-5]。由于蔬菜品种众多，育苗数量较大且空间密集，各类病害可能随种苗调运加速传播，育苗场对环境消毒和病害防治尤为重视，以免对生产造成严重影响[6-7]。与常规蔬菜栽培生产温室的消毒不同，育苗温室无需进行土壤消毒[8-9]，而需着重对棚室内环境，包括棚膜内表面和育苗床架等进行消毒，目前尚未有利用辣根素对育苗温室消毒处理的报道。

温室消毒一般利用育苗淡季的7—9月间开展，高锰酸钾+甲醛等药剂熏蒸处理和广谱性杀菌剂喷雾处理是最常见的2种育苗温室消毒方式[7,10]。近年来，随着提高农产品品质和质量安全的需求日益增加，减少使用高毒化学农药已成共识，生物源农药作为替代产品被越来越多地研究和应用。其中，辣根素是从辣根Armoracia rusticana(Lam.)Gaertn.,B.Mey.etScherb.等十字花科植物中提取出来的一类次生代谢产物，主要化学成分为异硫氰酸烯丙酯，其对仓储害虫、病原微生物、根结线虫、杂草等有害生物都呈现出良好的生物活性[11]。已有研究表明，实验室培养条件下，辣根素对26种常见的植物病原真菌、卵菌及细菌具有不同程度的熏蒸抑制活性[12]，应用于设施土壤消毒可以有效杀灭土壤中的微生物[13]，并减少草莓白粉病[14]、西瓜枯萎病的发病率[15]，辣根素与苦参碱复配闷棚处理可对线虫病害进行防控[16]。

本试验选取位于北京大兴区、通州区的3家中大型育苗场的日光温室，采用辣根素药剂喷雾后闷棚处理方式进行棚室消毒，对比处理前后温室环境、棚膜及育苗床架上微生物的数量及种类，并通过ITS测序明确病害种类，分析辣根素药剂施用对育苗温室的消毒效果，为生产实践提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验地点

选择位于北京通州和大兴的3个育苗场的日光温室（编号分别为温室一、温室二、温室三），均进行多种果菜和叶菜类蔬菜作物的集约化育苗生产，育苗场年育苗量都在800万株以上。3个育苗温室面积及上个生产年度育苗作物分别如表1所列。

表1 实验育苗温室面积及生产情况列表

1.2 温室消毒处理

试验于各育苗温室上茬生产结束后（2019年6月25日—28日）进行，温室内无作物。温室消毒处理使用药剂为：辣根素水乳剂（芥菜型，有效成分20%，云南联创利民生物工程有限公司生产），兑水稀释7.5倍使用，采用背负式常温烟雾机喷施，用量为450 L/hm2，施药后密闭闷棚48 h后放风再次取样。

1.3 温室空气微生物检测

采用自然沉降法进行温室空气中的微生物种类及数量检测[17]。温室消毒前和消毒后分别在固定位置放置营养肉汁酵母液琼脂培养基(NBY)和乳酸马铃薯琼脂培养基(aPDA)平皿，每个温室放置地点为两端和中央（图1），共6个位置（图1中●位置），每个位置放置2种培养基各1个平板，开盖自然沉降10 min后，用封口膜将培养皿密封。将培养皿编号后带回实验室，28℃培养观察菌落并计数。

图1 温室采样取样点示意图

1.4 温室设施表面微生物检测

通过无菌擦拭棒擦拭温室设施内表面收集表面真菌、细菌，再进行培养。具体操作如下：消毒处理前后分别在育苗温室3处固定位置（图1中▲位置）的棚膜及育苗床架使用无菌擦拭棒(3M SPONGE-STICK)进行擦拭取样，每次擦拭面积约60 cm2，擦拭棒放回样品袋密封带回实验室进行下一步操作。在样品袋中加入30 mL PBS缓冲液，用均质器震荡30 s，将缓冲液转至50 mL离心管中，10000 r/min离心10 min，倒去上清液加入1 mL无菌水均匀悬浮沉淀，取适量悬浮液进行10倍梯度稀释，每个稀释梯度菌悬液吸取100 μL均匀涂布到aPDA培养基及NBY培养基。每天观察培养基真菌、细菌生长情况，并计数，根据菌落数量推算出温室设施表面的带菌量（个/cm2），计算见公式(1)。

1.5 真菌、细菌种类鉴定

将分离到的不同种类的真菌转移到aPDA培养基，细菌转到NBY培养基上纯化。真菌通过显微镜观察菌丝和孢子的形态，结合真菌培养性状和形态学特征，参考相关工具书和文献鉴定到属[18-19]，并通过真菌、细菌ITS通用引物进行PCR扩增、测序分析进一步鉴定到种[20]。详细操作为：取真菌菌丝于1.5 mL离心管中，编号，放入液氮中充分冷却后取出充分研磨，之后采用核酸提取试剂盒（博迈德）提取DNA。以上述提取总DNA为模板，用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增[21]。细菌ITS扩增引物为8F/1492R[20]。PCR扩增体系为2 × Easy Taq pcr Supermix 25 μL，引物2 μL，ddH2O 19 μL，检测样品2 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃（真菌ITS）或50℃（细菌ITS）退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min，终止温度为4℃。反应结束后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳确认片段大小后，PCR产物送至公司测序（北京三博远志生物技术有限公司）。测序结果进行BLAST序列比对，鉴定到属或种。

1.6 数据处理

实验主要取得数据包括：消毒处理前后温室空气中真菌、细菌数量通过沉降平板检测数据；温室设施棚膜、育苗床表面通过擦拭采集培养获得的真菌、细菌数量数据。温室设施表面菌量数据进行log转换后比较分析。采用Minitab软件（版本：18）对总体消毒效果进行消毒处理、温室地点的双因素方差分析，对单个温室的消毒处理效果进行单因素方差分析(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 消毒处理及不同温室的消毒效果总体分析

综合比较分析温室之间与消毒处理对温室环境微生物的影响发现：不同温室间空气中菌量即沉降平板菌量，不论真菌和细菌均存在显著性差异，而设施表面菌量无显著差异；消毒处理前后，温室空气中真菌数量及温室设施表面细菌数量存在显著差异，而温室空气中细菌数量及温室设施表面真菌数量无显著差异（表2）。

表2 消毒处理及不同温室对菌落数影响的双因素方差分析结果（P值）

2.2 消毒处理前后温室空气中真菌、细菌数量比较

鉴于2.1中分析得出不同温室之间环境本身存在一定差异，分别对每个温室消毒处理前后空气的真菌、细菌数量进行了比较分析。结果表明：所有温室的沉降平板真菌菌落数量在消毒处理后均显著下降（图2）。同时，除温室一消毒处理前后细菌数量差异不显著外，另2个温室的沉降平板的细菌菌落数在消毒处理后也显著降低（图3）。

图2 消毒处理前后沉降平板真菌菌落数比较分析

图3 消毒处理前后沉降平板细菌菌落数比较分析

2.3 消毒处理对温室表面细菌消毒效果

根据2.1中分析消毒处理后对温室表面的真菌数量影响不显著，因此单独针对每个温室的棚膜表面和育苗床表面细菌数量做了差异性比较与分析。结果表明：3个温室中棚膜表面、育苗床表面细菌数量在消毒处理后均有所下降。尤其温室二和温室三中的育苗床表面细菌带菌数量在处理后与处理前相比显著降低，菌落总数约降低了1个数量级，达到90%以上的杀菌效果（表3）。

表3 消毒处理对温室设施表面细菌消毒效果

2.4 温室环境沉降真菌、细菌种类鉴定分析

通过ITS测序鉴定出的沉降平板真菌种类主要有5 种 ：Alternaria、Rhizopus、Aspergillus、Penicillium、Curvularia，其中温室一检测到上述全部真菌，温室二检测到上述前4种真菌，温室三检测到上述前3种真菌。在检测到的真菌中，Alternaria中有2个种为植物致病菌，分别是 Alternaria tenuissima、Alternaria.Alternata，通过消毒处理前后的分析比较发现，主要真菌尤其是植物致病菌的数量在处理后都明显下降（表4）。此外处理前后的主要菌群有明显变化，如温室二处理前主要是致病菌链格孢Alternaria分离比率最高，占40.84%，而处理后链格孢比率下降，曲霉Aspergillus比例上升至63.46%。

表4 沉降平板真菌种类消毒处理前后对比

沉降平板分离纯化细菌，通过ITS测序鉴定细菌类别较多，共18种（表5），但未发现重要植物病原细菌。

表5 沉降平板细菌种类鉴定结果

3 结论与讨论

本研究发现，辣根素喷雾对3个育苗温室都有较好的消毒效果，虽然3个育苗场地理位置相近、生产作物相似，但温室内空气带菌量差异显著，可能由于空棚期进行空气采样容易受到温室周围环境、温室通风情况等影响；而苗床和棚膜等设施表面带菌量无显著差异，则可能由于设施表面的附着菌相对固定且较空气中数量少，主要与作物种类、发病情况、生产和用药习惯等相关。

已有研究表明，一定浓度的辣根素对真菌[12-13,22]、细菌[12]都具有显著的抑制作用，而本研究也表明，所有温室的沉降平板真菌菌落数量在消毒处理后均显著下降，其中2个温室的沉降平板的细菌菌落数也在消毒处理后显著降低。同时，消毒处理后，所有温室棚膜表面和育苗床表面的细菌总菌量也有所下降。尤其温室二和温室三中的育苗床表面带菌量在处理后显著降低，菌落总数甚至降低了将近1个数量级，达到90%以上的杀菌效果，显示出辣根素熏蒸对温室环境空气、尤其是内部及设备表面附着菌的杀菌效果非常显著。

本实验通过ITS测序鉴定出沉降平板真菌5种、细菌18种，其中含植物致病真菌链格孢属2种。链格孢属真菌是引起蔬菜发病的主要病原菌，可侵染约100种蔬菜，严重威胁着蔬菜产业的发展[23]。本研究鉴定出的细极链格孢菌A.tenuissima、链格孢A.alternate2个植物致病菌种，分别可引发西兰花黑斑病、白菜黑斑病[24]，番茄早疫病[25]及白菜黑斑病、甘蓝黑斑病、青花菜黑斑病、番茄早疫病、茄子叶斑病、辣椒叶斑病[23]、甜椒黑斑病、甜椒早疫病[26]、番茄茎枯病[27]等多种病害。以番茄早疫病为例，其在集约化育苗生产中为常见病害，即使秧苗肉眼所见不发病，带菌检出率也可高达86.67%[28]。实验结果再次证明蔬菜生产从苗期开始即容易接触和携带病原菌，专业集约化育苗场更应从源头重视环境消毒和病虫害防治，或可建立对出圃幼苗进行常见病害抽检，以培育无病健壮幼苗，减少苗期病害随种苗调运传播，危害田间生产。

辣根素是自然界的天然产物，易降解且对环境污染的可能性极小，推进以其为代表的植物源药剂使用具有积极意义。本项研究采用辣根素进行育苗温室消毒处理结果表明，处理后温室环境空气中的真菌及细菌数量均有显著降低，温室设施棚膜及育苗床表面细菌量均有所下降，部分温室育苗床表面菌落数降低达到1个数量级，效果十分显著。同时，消毒处理还显著降低了5类测序鉴定出的真菌，尤其是2类植物致病真菌的数量和分离比率。总之，本实验表明，辣根素作为育苗温室消毒药剂对温室环境及设施表面具有较好的消毒效果，可在生产中进一步推广应用，下一步将对辣根素作为温室熏蒸药剂对于植物病原细菌的杀灭效果进行研究验证。