植物甙牙膏的开发及功效研究

高 艳 肖 蕾 车 飙 黄金莲 雷发玲 易 丹 何陵玲

(无限极(中国)有限公司，广东 广州 510663)

1 前言

口腔为消化道的起始部分，具有重要的生理机能，参与消化、协助发音、言语动作、感觉等功能，并辅助呼吸。口腔包含多个器官，牙齿只是其中一部分。口腔的前壁及侧壁为唇和颊；上壁由硬腭和软腭构成口腔顶；下壁为口腔底，为舌和围绕舌根的宽沟所占据。人体是一个统一的整体，各部分之间在生理上互相联系，在病理上相互影响。口腔位居头面部，为五官之一，是人体重要组成部分，具有进水谷、辨五味、泌津液、磨谷物、助消化及发语音等功能，为胃系之所属，乃心脾之外窍，经络循行交会之处。口齿为脏腑之门户。口腔生理功能及病理变化均与五脏六腑有着密切的关系，脏腑生理及病理变化常反应于所主的口腔不同部位[1]。

世界卫生组织给口腔健康的标准下定义是：牙齿清洁，无龋洞，无疼痛感，牙龈颜色正常，无出血现象。中国居民口腔健康指南定义口腔健康是：无口腔颌面部慢性疼痛、无口咽癌、无口腔溃疡、无先天性缺陷如唇腭裂、无牙周(牙龈)疾病、无龋病及牙齿丧失、无影响口腔的其他疾病和功能紊乱[2]。无论是世界卫生组织还是中国居民口腔健康指南对口腔健康标准并不局限于牙齿上，而是包含了牙龈、牙齿、口腔粘膜、咽、颌面部、唇等口腔内所有部位。

专利ZL201710571711.8《一种口腔健康评估算法、装置及系统》综合现代医学对口腔问题的评价与解释和中医对口腔疾病、周身健康状态的阐述，将人们常见口腔问题的发生机制、表现症状进行梳理和归类，将居民常见口腔问题分为牙齿、牙龈、口腔环境及口腔溃疡4大维度，共10个关注点，包括龋齿、牙齿敏感、牙龈出血、牙龈肿痛、牙龈萎缩、牙齿松动、牙结石、牙渍、口腔异味和口腔溃疡，并以此建立了一套评价口腔健康指数(Oral-health Factor” ，OHF)的专利算法。其中牙齿维度包含龋齿和牙齿敏感；牙龈维度包含牙龈出血、牙龈肿痛、牙龈萎缩、牙齿松动和牙结石；口腔环境维度包含牙渍和口腔异味；口腔溃疡为单独一个维度[3]。

口腔健康不能只局限在牙齿上，需要从牙龈、牙齿、口腔环境、口腔溃疡等多角度、多维度整体、综合解决问题。

2 植物甙

植物甙是植物体内产生的、由一分子天然非糖化合物(甙元/苷元)与一个或多个糖或糖的衍生物分子(糖元)缩合而成的次级代谢产物的统称，结构式如图1。苷元又称甙元，是糖苷类化合物中，与糖缩合的非糖部分。苷元通过氧原子与糖元结合为氧苷；与硫原子结合是硫苷；与羧酸根结合是糖酯；与胺基结合是氮苷；由碳原子直接与糖元连接，称为碳苷[4]。

图1 植物甙分子结构式

植物中的植物甙类活性成分对人体有广泛的生理药理功效。其中，黄芩中的黄芩苷具有降压、镇静、保肝、抗菌、消炎等多种药理作用[5]。积雪草中的积雪草苷具有抗肿瘤、抗纤维化、抗炎、抗阿尔茨海默病、改善学习记忆能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修复皮肤损伤等多种药理作用[6]。虎杖中的虎杖苷有改善心肌损伤、保护血管、降血脂、抗脂质过氧化、抗肺动脉高压、抗休克血管损伤以及抗血栓等心血管方面的作用，还具有抗炎、保护骨髓、促进创面愈合、抗辐射等药理活性[7]。甘草总皂苷能够通过抑制COX-2的表达以及炎性因子的活性，从而影响前列腺素E2的合成。甘草苷可以通过提高超氧化歧酶活性，提高体内抗氧化酶的活性，减少自由基，抑制体内过氧化物的生成，通过抗自由基的方式来改善抑郁症。甘草苷能够有效的降低模型动物的心率，减少乌头碱的心脏毒性，同时扩大乌头碱对心脏作用的安全使用范围[9]。

因此在牙膏中添加植物甙类活性成分，可增加牙膏的口腔健康护理功效。本研究研制开发了一款含植物甙的牙膏，其植物甙来自积雪草、虎杖根、黄芩根、茶叶、光果甘草根等多种植物。从牙齿、牙龈、口腔环境、口腔溃疡及安全性等5个维度对所研制的植物甙牙膏进行了测评，验证此款植物甙牙膏在预防或缓解口腔问题上的功效及其安全性。

3 功效评价方法

3.1 牙齿维度评价

氟化物进入人体后很容易被吸收且绝大部分被存储在体内的矿化组织中，如骨和牙齿。氟可以通过血液进入人体组织，也可以通过牙面直接获取。牙齿萌出后，釉质内的氟主要来自唾液，牙本质内的氟则来自血液循环系统。许多研究证明氟可被釉质中的羟磷灰石吸收形成氟磷灰石，釉质中氟磷灰石的增加能降低牙釉质溶解性，增强牙釉质抗酸性以及再矿化效能。氟可以抑制口腔链球菌利用葡萄糖产酸、抑制获得性膜的形成，以及抑制牙面上细菌堆积。WHO已规定可以将含氟牙膏作为局部用氟化物防龋措施。20世纪初期，氟化物已被用在牙膏上，预防龋齿[9]。

GB/T 8372-2017中规定了防龋牙膏中成人牙膏含氟量为1000～1500ppm，儿童牙膏为500～1000ppm。

选用GB/T 8372-2017中游离氟和总氟含量的检测方法，检测植物甙牙膏中氟含量。

3.2 牙龈维度评价

3.2.1 抑菌测试

试验菌株选择金黄色葡萄球菌( ATCC 6538) 、大肠杆菌( ATCC 25922 )、白色念珠菌( ATCC 10231)、表皮葡萄球菌( ATCC 12228)、牙龈卟啉单胞菌( ATCC 33277)、变异链球菌 ( ATCC 700610)、粘性放线菌( C505)。参照QB/T2738-2012 第7.3进行试验，分别测试用去离子水将牙膏稀释3倍、100倍后样品的抑菌率，作用时间2min，试验重复3 次，取平均值。

3.2.2 临床试验

采用QB/T 2966-2014功效型牙膏标准规定的《牙膏功效评价中的抑制牙菌斑和(或)减轻牙龈炎症功效(WS/T 326.3-2010)》评价植物甙牙膏抑制牙菌斑和减轻牙龈炎的有效性。

3.3 口腔环境维度评价

3.3.1 去除外源性色斑效果评价

先用牛牙牙釉质制作牙釉质样本块，随后进行打磨、抛光、清洗、酸蚀等处理，得到无差异的牛牙牙釉质块。用咖啡、红茶、胃粘蛋白、酱油、氯化铁等配制一定浓度的染色液，将处理过的牛牙釉质块浸泡在染色液中，持续染色12d。将染色后的牙釉质块编号并标记好，用色差计测量牙釉质的颜色(L*刷牙前)，选择L*值在30～50的牙釉质块，随机分组，每组8块。用去离子水将测试样品和对照组牙膏配制成一定浓度的牙膏浆液。将染色后的牙釉质块放入自动机械刷牙机的固定槽内固定，安装牙刷头，使刷毛垂直接触牙釉质表面。称取相同重量的待测样品匀浆放入自动机械刷牙机上，使牙膏浆埋没牙釉质样本，往返刷牙800次。刷牙结束后，将牙釉质样本从刷牙机上取出，用水冲洗干净，用纸巾吸干水，晾干。之后测定刷牙后牙釉质颜色(L*刷牙后)，并计算刷牙前后L*值的差值△L*=L*刷牙后-L*刷牙前。采用SPSS20.0 统计软件，独立样本t 检验。如果样品组△L*值大于对照组△L*值，且两组△L*值比较有统计学意义(P<0.05)，可认为受试物能有效去除外源性色斑。

3.3.2 预防外源性色斑附着效果评价

先用咖啡、红茶、胃粘蛋白、酱油、氯化铁等配制一定浓度的染色液及人工唾液，将羟基磷灰石(HAP)片随机分组，每组8个，用色差计测量L*值，记为L*处理前。将羟基磷灰石片浸泡在人工唾液中，放置于37℃恒温箱1.5小时，以便在羟基磷灰石片表面形成生物膜。用去离子水将测试样品配制成一定浓度的牙膏浆。将分组后的羟基磷灰石片分别浸泡在试验样品和对照组牙膏浆中，3分钟后取出，在清水中蘸洗后，用吸水纸擦干。随后，同时浸泡在染色液中3分钟，取出羟基磷灰石片用清水蘸洗，并用吸水纸擦干，然后用色差计测量L*值，记为L*处理后。比较试验样品与对照组羟基磷灰石片的L*值，L*值越大，表明羟基磷灰石片白度越大，证明牙膏预防色斑形成的能力越强。采用SPSS20.0统计软件，独立样本t检验。如果测试样品L*值大于对照组L*值，且两组L*值比较有统计学意义(P<0.05)，可认为受试物具有预防色斑的功效。

3.4 口腔溃疡维度评价

取健康刚成年的雄性SD大鼠，腹腔注射麻醉，苯酚烧灼法进行造模。造模成功判断标准：被烧灼区形成圆形或椭圆形直径约5mm的溃疡，周围有红肿隆起，粘膜表面粗糙不平，有灰白或黄色假膜，活动量、摄食量、饮水量减少、大便较稀。造模后第2天，取造模成功的口腔溃疡雄性SD大鼠数量30只，随机分成3组，每组10只，即模型组、植物甙牙膏组、西瓜霜组，其中西瓜霜为阳性对照组。用消毒棉签黏取相应药物涂布于口腔溃疡处，植物甙牙膏和西瓜霜粉末均完全覆盖创面，每天涂抹2次，给药间隔6h，连续治疗5d，以溃疡完全愈合为结束终点。每天观测口腔粘膜的变化，测定无水肿粘膜溃疡面积，观察炎症充血情况，并用数码相机对溃疡变化进行拍照记录。检测时间点：造模后涂抹前、给药2、4、6天。用游标卡尺测得溃疡直径，并计算溃疡面积。同时计算单位时间内各动物的摄水量和摄食量。

评定指标：在涂抹后的第5d记录溃疡面积：<1mm2为愈合，≥1mm2为未愈合。模型组为不给任何药物组。西瓜霜来源桂林三金药业股份有限公司，灰黄绿色粉末。

3.5 安全性评价

3.5.1 磨擦值检测

因含有固体磨料，长年累月使用磨擦值大的牙膏，虽然能很好清洁牙齿，但也会磨损牙齿，造成牙釉质流失。磨损值越大，对牙齿磨损程度越高。选择牙膏要选用清洁率高、磨擦值小的产品。采用《牙膏磨擦值测试方法(GB/T 35832-2018)》来测试牙膏的磨擦值Ra。磨擦值越小，说明牙膏对牙齿的磨损越小。

美白牙膏要达到去除牙面色斑的效果，在磨料清洁、去渍上会比其他类型的牙膏高，相应的磨擦值也会更高，因此选用宣称具有美白牙膏功效的牙膏作为对照样品，测试植物甙牙膏的磨擦值相对高低。

3.5.2 急性经口毒性试验

选用20g左右的KM小鼠10只，雌雄各半，SPF级。称取植物甙牙膏5g，加入纯水配置成10mL样品溶液。采用一次最大限度试验，只设5000mg/kg体重一个剂量组。试验前10只小鼠全部禁食过夜，不限饮水。空腹灌胃1次，每次灌胃容量10.0mL/kg体重。染毒后立即观察并记录动物的中毒表现、死亡数和死亡时间，观察期14d，试验结束时未死亡动物称重。按《化妆品安全技术规范》(2015年版)急性经口毒性试验评价规定判断毒性分级。

3.5.3 急性眼刺激试验

选用3只普通级新西兰雌兔2.2kg左右。称取0.1mL植物甙牙膏涂抹兔一侧眼结膜囊内，被动闭合1s，30s后用生理盐水冲洗，另一侧眼睛不处理作为对照。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d、21d肉眼观察兔眼结膜、虹膜、角膜损失与恢复情况并进行评分。如果72h未出现刺激反应，或第7d或14d眼睛刺激反应完全恢复，可提前终止试验。按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)急性眼刺激性试验规定进行结果判定。

4 结果

4.1 牙膏中氟含量

在植物甙牙膏中添加氟化钠含量为0.32%，理论含氟量是0.145%。检测植物甙牙膏起始、常温存放1年、2年以及45℃老化3个月时的氟含量，结果如表1。根据表1的结果，常温存放两年及45℃老化3个月后，牙膏中氟含量稳定，几乎没有下降。植雅甙牙膏中氟含量很稳定，氟和植物甙成分相容性较好。

表1 植物甙牙膏中氟含量随时间变化

4.2 抑菌测试

刷牙时，牙膏会被唾液稀释。实验分别用3和100倍去离子水稀释牙膏，制得牙膏浆液后，测其抑菌率，结果如表2。用3和100倍去离子水稀释牙膏是分别模拟牙膏在正常刷牙过程中可能被稀释的倍数以及被无限稀释后的状态。

表2 植物甙牙膏的抑菌率

由表2 的结果可知，植物甙牙膏被稀释3倍，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、表皮葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、粘性放线菌均有抑菌作用；稀释100倍后，牙膏对金黄色葡萄球菌、粘性放线菌仍具有抑菌作用。

4.3 临床试验

临床试验结果是85例受试者均完成了试验。经独立性样本T检验，两组基线无显著性差异(P>0.05)。整个试验过程中，试验对象及检查者均没有牙膏副作用的报告。基线检查结果见表3。

表3 试验对象的基线检查结果

使用牙膏后1.5个月和3个月的检查结果见表4。与对照牙膏相比，使用植物甙牙膏1.5个月，分别减少牙龈炎指数及龈上菌斑指数为14.72%(P<0.05)与9.89%(P<0.05)；使用植物甙牙膏3个月，分别减少的牙龈炎指数及龈上菌斑指数为15.89%(P<0.05)与22.98%(P<0.05)。

表4 试验前后受试者牙龈指数与菌斑指数变化情况

临床试验结果显示，使用植物甙牙膏具有抑制牙菌斑、控制牙菌斑形成、降低龈炎指数、减轻牙龈炎症的功效。

4.4 去除外源性色斑效果评价

选用市售普通不宣称美白功效的含氟牙膏作为阴性对照组，选用市售宣称美白的水合硅石体系的牙膏作为阳性对照组，与植物甙牙膏同步测试去除外源性色斑的效果，结果如下表5。

表5 植物甙牙膏去除外源性色斑效果

由表5的结果可知，与阴性对照组牙膏比较，植物甙牙膏可有效去除咖啡、红茶、酱油等污渍引起的牙釉质外源性色斑。与阳性对照组牙膏相比，植物甙牙膏提高染色牛牙的亮度值更高。

4.5 预防外源性色斑附着效果评价

选用与4.4一样的阴性对照样和阳性对照样。与植物甙牙膏同步测试预防外源性色斑的效果，结果如下表6。

表6 植物甙牙膏预防外源性色斑附着效果

由表6的结果可知，与阴性对照组牙膏比较，植物甙牙膏可有效预防咖啡、红茶、酱油等引起的外源性色斑附着；与阳性对照组牙膏效果相当。

4.6 口腔溃疡效果试验

模型组、西瓜霜组、植物甙牙膏组对大鼠口腔溃疡影响结果如表7。由表7结果可知，与模型组对比，使用植物甙牙膏3天就有显著性促进大鼠口腔溃疡愈合的效果，其效果与西瓜霜相当。

表7 植物甙牙膏对苯酚烧灼法致SD大鼠口腔溃疡面积的影响

4.7 磨擦值检测

筛选市售宣称美白的水合硅石体系牙膏和碳酸钙体系牙膏作为对比样，其中水合硅石体系牙膏选择了宣称含有高清洁型二氧化硅(简称HCS二氧化硅)和不宣称含有高清洁型二氧化硅两种类型的美白牙膏。三种牙膏与植物甙牙膏同时测试磨擦值，结果如下表8。

表8 植物甙牙膏的磨擦值Ra

由表8的结果可知，在美白类产品中，植物甙牙膏的磨擦值适中稍偏低，略高于不宣称含有高清洁型二氧化硅的美白牙膏，远远低于含HCS水合硅石体系牙膏和碳酸钙体系的牙膏。

4.8 急性经口毒性试验

急性经口毒性试验染毒后，实验小鼠未见任何中毒症状和死亡，实验结束后对存活动物解剖，肉眼未见异常。植物甙牙膏对雌雄性KM小鼠急性经口毒性LD50>5000mg/kg 体重，属实际无毒级。

4.9 急性眼刺激试验

植物甙牙膏原样对新西兰兔急性眼刺激试验的3只动物角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿的积分均值为0，根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章毒理学试验方法5急性眼刺激性/腐蚀性试验反应分级标准，属无刺激性。

5 结论

植物甙成分是植物体内的次级代谢产物，具有消炎、抗氧化、止痛、抗菌、抗病毒、清热、抗炎等多种作用。将植物甙加入牙膏中，通过刷牙，局部暂短接触给药方式，帮助人们改善各种口腔问题。从牙齿、牙龈、口腔环境、口腔溃疡及安全性等多个维度研究了植物甙牙膏的功效和安全性，结果表明本研究的植物甙牙膏具有防龋、坚固牙釉质、抑制牙菌斑、降低牙龈炎、促进口腔溃疡愈合、去除外源性色斑及与预防色斑附着等多种功效。经安全性测试，植物甙牙膏磨擦值适中、急性经口毒性试验属无毒级、急性眼刺激试验属无刺激性，且临床试验无不良反应发生，说明此植物甙牙膏安全可靠。

人体是一个统一的整体，各个部分之间在生理上互相联系，在病理上相互影响。口腔位居头面部，为五官之一，是人体重要组成部分。我国的口腔疾病患病率和发病率均较高，是影响我国居民健康常见病和多发病。口腔疾病已经成为危及居民健康的主要公共卫生问题之一。口腔疾病对全身性疾病也有关联和影响。如，牙周感染会提高患者外周血中G-反应蛋白及其他生物标记物的浓度，导致系统性炎症的水平升高，并通过多种机制参与或促进动脉粥样硬化的形成；口腔慢性病灶可以增加呼吸道感染的发病率，使呼吸道致病菌增殖而发生感染；糖尿病和牙周炎之间存在双向相关关系。口腔健康关系到全身健康，要呵护牙齿，保持口腔清洁、卫生，减少和降低各种口腔疾病的发生。口腔包含牙齿、牙龈、舌、咽、粘膜、软腭、硬腭等多个部位，对口腔呵护不能只局限在牙齿上，从牙龈、牙齿、口腔环境、口腔溃疡等多个维度整体、综合护理，使口腔保持健康状态。