酶放大免疫法与荧光免疫层析法检测万古霉素血液浓度的对比研究

师亚玲，丰 航，廉江平，张 鹏，李 黎（陕西省人民医院药学部，西安 710068）

万古霉素（vancomycin）是一种糖肽类的抗生素，是目前治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcus aureus,MRSA）感染的首选药物。万古霉素具有一定的肾毒性与耳毒性，因其治疗窗窄，个体差异较大，血液浓度过低可能导致耐药性或治疗无效，血液浓度过高容易诱发严重不良反应，因此需要对患者的血液浓度进行监测[1-2]。研究表明，对万古霉素的血液浓度进行监测可以提高临床治疗的有效性，减少不良反应的发生[1]。

目前，万古霉素血液浓度监测方法有微生物法、色谱法和免疫学方法[3-4]。酶放大免疫法（enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT）是免疫法的一种，是目前临床应用较为普遍的一种方法，其通过测量酶活性来估计样品中半抗原的量，根据吸光度的变化测定酶活性的变化，从而确定血液浓度。荧光免疫层析法（fluorescence immunochromatography assay,FICA）是利用现有的技术开发出应用于血液浓度检测的一种方法，其利用层析夹心法的工作原理，通过标记荧光结合物转化为定量的结果。EMIT 有商业试剂盒，样品处理简单，测量速度快，准确度高，可以同时测量多个样品，目前临床应用较为广泛[5-6]，但其仪器及试剂盒昂贵，对检测环境和试剂存放温度要求严格，样本检测成本相对较高。FICA 法成本相对较低，对环境温度无严格要求，目前已开发出其应用于血液浓度检测的商业仪器及试剂盒，但其国内应用较少，检测结果的准确度尚未有文献报道。本研究使用EMIT 法和FICA 法分别检测万古霉素血液浓度，并对其进行分析比较，确定检测方法间的一致性，以期为临床提供一种快速简便的万古霉素血液浓度检测方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2020年9月～11月我院住院患者静脉滴注万古霉素需要进行血液浓度检测的样本，共计121 例。其中男性74 例，女性47 例，平均年龄45.2±6.3 岁。患者主要分布在呼吸内科（34.8%）、重症医学科（42.3%）和急诊外科（22.9%）。患者平均住院日为23.9±11.9 天，住院期间万古霉素平均使用时间为8.2±7.2 天。

1.2 仪器与试剂 EMIT 法使用全自动临床化学分析仪Viva-E（德国西门子公司），所用万古霉素检测试剂及配套定标液（6 个万古霉素浓度水平）均由西门子公司提供。FICA 法使用金浩峰KHF01 荧光免疫分析仪（北京丹大生物技术有限公司），所用万古霉素测定试剂盒由北京丹大生物技术有限公司提供。TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂），治疗药物监测质控物（美国伯乐公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：对于肾功能正常的成人患者，开始给药后大于48h 检测万古霉素血液浓度，而对于肾功能不全的成人患者，开始给药后大于72h 检测万古霉素血液浓度，并根据患者肾脏功能调整检测时机[7]。所有患者每次给药1g，间隔为每8h 或每12h。在患者体内血液浓度达稳态后，于患者当日清晨用药前30min 采集全血，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集2～3ml，3 500r/min 离心5min，取上层血浆检测。

1.3.2 FICA 法样品测定：测定前按要求将仪器各参数校准至最佳状态。将试剂盒配套的校准信息卡信息录入，并选择相应样本类型的校准曲线。对中、低质控品进行检测以确定结果的准确性和有效性。将样本按照仪器及试剂盒要求的标准操作规程进行测定。

1.3.3 EMIT 法样品测定：测定前按要求将仪器各参数校准置最佳状态。取浓度为0，5，10，20，30和50μg/ml 万古霉素定标液进行上样检测，拟合标准曲线。对中、低质控品进行检测以确定结果的准确性和有效性。将样本按照仪器及试剂盒要求的标准操作规程进行测定。

1.3.4 回收率试验：质控品取中、低质控品各5 份，上样后测定其实际浓度，与理论值进行比较，计算回收率。低质控靶值为11.30μg/ml，中质控靶值为30.10μg/ml，回收率=（理论浓度/实测浓度）×100%。

1.3.5 精密度试验：取中、低质控品各5 份，上样后在不同仪器同一日内分别连续检测5 次，计算日内精密度。在不同仪器不同日内检测5 次，计算日间精密度。

1.4 统计学分析 使用SPSS18.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差(±s)表示，对两组数据进行配对样本t检验，采用Pearson 相关分析和Bland-Altman 分析考察两组结果的相关性和一致性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法测定结果的方法学分析 见表1。EMIT 法和FICA 法日间和日内精密度均＜20%。EMIT 法测定回收率在99.8%～106.4%之间，FICA法测定回收率在98.4%～107.2%之间。两种方法检测精密度和回收率均符合生物样品检定要求。

表1 EMIT 法与FICA 法精密度结果比较[（±s）μg/ml，RSD%]

表1 EMIT 法与FICA 法精密度结果比较[（±s）μg/ml，RSD%]

质量浓度（μg/ml）EMITFICA日内精密度日间精密度日内精密度日间精密度11.3012.70±0.21，1.6512.75±0.87，6.8213.18±0.26，1.9713.37±1.01，7.55 30.1032.75±0.66，2.0231.40±1.15，3.6632.93±1.98，6.0133.82±2.22，6.56

2.2 两种方法测定结果比较 EMIT 法测定121个样品结果均值为18.83±11.24μg/ml，范围在2.20～46.70μg/ml 之间。FICA 法检测结果均值为18.16±9.67μg/ml，范围在1.81～37.18μg/ml 之间。配对样本的t检验结果表明，两种方法检测结果差异无统计学意义（t=1.584,P=0.117）。

2.3 两种方法测定结果相关性和一致性分析 对两组数据结果做散点图见图1，表明两种方法测定结果呈正相关（r2=0.894 6）。根据Pearson 双变量相关分析结果，两种方法的检测结果相关系数为r=0.946（P＜0.05），说明其测定结果高度相关。采用Bland-Altman 分析比较检测结果的一致性，其平均偏差为0.67±3.78μg/ml。以两组结果的均值为X轴，差值为Y轴做图，结果如图2。95%一致性界限范围为-6.74～8.09，有115个数据在一致性界限内（95.0%），说明这两种测定方法有较好的一致性。

图1 EMIT 法和FICA 法测定结果散点图

3 讨论

本研究利用EMIT 法和FICA 法检测万古霉素血液浓度。EMIT 法是基于样本中万古霉素和酶试剂中葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH）标记的万古霉素竞争抗体结合位点，导致吸光度变化，根据吸光度的变化测定酶活性的变化，从而确定万古霉素的血药浓度[5,8]。FICA 法是基于抗原特异性免疫反应的新型膜检测技术，该技术以条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体固定于连接垫，通过毛细血管作用使待分析物在层析条上移动，待测小分子抗原与荧光抗体结合后，剩余的荧光标记抗体与检测线上的包被抗体结合，通过内建曲线计算出样本浓度。本研究结果表明，EMIT 法测定结果均值高于FICA 法，分析可能原因为两种方法原理不同，检测结果可能存在一定差异，另外FICA 法在对样本稀释过程中由于人员的操作对结果产生影响，而EMIT 法在测定过程中由于环境温度变化等因素也会造成结果的偏差，但两种方法检测结果的差异无统计学意义（t=1.584,P=0.117）。

EMIT 法线性范围为2.00～50.00μg/ml，FICA法线性范围为1.00～40.00μg/ml。在准确度和精密度的比较中，由于所使用的高质控靶值为52.60μg/ml，超过了两种检测方法线性范围，所以只进行中、低质控的分析。由于两种方法线性范围存在差异，因此在临床测定万古霉素血液浓度时，为保证检测结果的准确性，可根据样本可能的分布范围选择适合的检测方法。EMIT 法有商业试剂盒，样品处理简单，可以同时测量多个样品，但仪器及配套试剂价格较为昂贵，对实验室检测温度要求高（18℃～28℃），试剂盒需在2℃～8℃冰箱保存[9-10]，试剂盒为120 人份包装，有效期较短，此方法适用于样本量较大，经费充足的医疗机构[8,11]。FICA法样本处理中存在两步稀释过程，因此人员的操作对最终结果影响较大，其试剂盒为单人份包装，使用一次性测试卡，可以有效避免试剂浪费，仪器及配套试剂价格相对较低，试剂盒可在2℃～30℃条件下储存，有效期较长（18 个月），此方法适用于样本量较少、经费有限的基层医疗机构[12]。

综上所述，EMIT法测定结果均值高于FICA法，但其差异无统计学意义（t=1.584,P=0.117），两种方法所得结果间具有相关性和一致性。由于两种方法线性范围存在差异，因此在临床测定万古霉素血液浓度时，为保证检测结果的准确性，可根据样本可能的分布范围选择适合的检测方法。EMIT 法和FICA 法均为有效可靠的万古霉素血液浓度检测方法，在临床选择测定方法时，应综合考虑样本、实验室条件、人员配置等因素。