阴离子交换色谱测定乳粉中2’-岩藻糖基乳糖

喻斌斌，叶文慧，刘彪

内蒙古伊利实业集团股份有限公司（呼和浩特 010110）

母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪，HMOs除了为新生儿提供营养之外，还可以选择性地促进有益细菌在肠道中的生长，防止病原性细菌的粘附，调节婴幼儿的免疫系统，从而降低新生儿的患病风险[1-2]。其中2’-FL含量最高，为0.76～4.78 g/L[3-4]，约占分泌型母亲HMOs总量的30%[5]。

牛乳中低聚糖的含量约为成熟母乳的1/20[6]，羊乳中低聚糖含量很少，仅为0.25～0.30 g/L[7]。婴幼儿配方乳粉基粉主要是牛乳和羊乳，在婴幼儿配方食品中添加适量的HMOs成分是实现母乳化的重要标志。在开发含HMOs配方的过程中，必须开发出测定婴幼儿配方乳粉成品中HMOs含量的方法，除了用于标签符合性的质量控制外，还用于确认耐受性、安全性、有效性试验的产品中的HMOs水平，并确保婴幼儿配方乳粉生产过程中的HMOs含量稳定性[8]。

目前HMOs的定量测定方法有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[9-11]、液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）法[12-14]、核磁（nuclear magnetic resonance，NMR）法[15]、离子色谱（ion chromatography，IC）法[16-18]等。但大多数方法测定的目标样本是母乳，婴幼儿配方乳粉中2’-FL的含量水平远低于乳糖，检测时受乳糖干扰明显，同时还有其他糖类及蛋白质等的干扰。HPLC法需对样品进行衍生，操作繁琐且重复性较差；LC-MS法在乳品复杂的基质下回收率不理想，并且很难找到合适的内标消除误差；NMR法灵敏度较差[19]。而IC法具有无需衍生、操作简便、分离度好、灵敏度高等优点[20]，更加高效、快速和准确。此次试验建立了采用高效阴离子交换色谱-脉冲电化学检测法（HPAEC-PAD）对婴幼儿配方乳粉中2’-FL进行定量的检测方法，并在婴幼儿配方乳粉基质中进行方法学验证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICS-3000离子色谱仪，配电化学检测器，赛默飞世尔科技公司；超声波清洗器，湖北鼎泰高科有限公司；漩涡振荡器，德国IKA；分析天平，梅特勒-托利多；定量比色管，北玻；容量瓶，天玻；净化柱，赛默飞世尔科技公司，Dionex OnGuard II RP Cartridges；注射器，探索精选；0.45 μm滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。

2’-岩藻糖基乳糖标准品，CAS：41263-94-9，纯度90.0%，英国Carbosynth公司；甲醇，色谱纯；50%氢氧化钠；磺基水杨酸，优级纯；试验用水，超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

2’-岩藻糖基乳糖标准品溶液（0.5 mg/mL）的配制：称取5 mg 2’-岩藻糖基乳糖标准品，用水溶解并定容至10 mL，计算时校正纯度。

2’-岩藻糖基乳糖标准系列工作溶液的配制：将2’-岩藻糖基乳糖标准溶液用水稀释制备一系列标准溶液，标准系列质量浓度为0.25，0.5，1.25，2.5，5，10和20 μg/mL。临用前配制。

1.2.2 样品前处理

称取0.4 g左右（精确到0.1 mg）乳粉样品于100 mL定量比色管中，加入40 mL水溶解，于漩涡振荡器振摇2 min充分混匀，加入20 mL 3%磺基水杨酸溶液，加水定容至刻度后摇匀，超声波超声提取10 min。摇匀后定性滤纸过滤。

活化净化柱，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水进行活化，放置0.5 h后使用。

试样溶液依次通过0.45 μm滤膜和净化柱，弃去前面2倍柱体积滤液，收集后面的滤液上机测定。

1.2.3 仪器条件

离子色谱柱：赛默飞DIONEX CarboPacTM PA1柱，4 mm×250 mm，10 μm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；淋洗液：A为去离子水，B为200 mmol/L NaOH水溶液，梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.1及Microsoft Office Excel软件进行数据处理和统计学分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 样品沉淀剂的选择

比较使用0.15%乙酸、60%乙醇、3%磺基水杨酸溶液沉淀蛋白的效果。除沉淀剂不同外，其他均按1.2方法进行操作。各预处理方法的样品测定分析结果见表2。结果表明，磺基水杨酸沉淀法对于乳粉中蛋白的沉淀效果最好。因此，选用3%磺基水杨酸溶液作为此次试验的沉淀剂。

表2 不同预处理方法下样品测定分析结果对比表

2.2 色谱条件的选择

离子色谱的流动相中，洗脱能力强弱顺序：NaAc溶液＞NaOH溶液＞水。通过在阴性乳粉中添加2’-FL标准品，对比分别使用NaAc溶液-NaOH溶液-水体系（图1）和NaOH溶液-水体系（图2）进行洗脱的效果，两种方法均使用最优洗脱梯度条件。图1中阴性乳粉在2’-FL目标峰附近有杂峰，导致加标后样品2’-FL目标峰出现驼峰现象，而图2中2’-FL目标峰峰型标准，不受乳粉基质中其他物质干扰。结果表明，NaOH溶液-水体系的洗脱效果更优。

图1 使用NaAc溶液-NaOH溶液-水体系洗脱的样品色谱图

图2 添加2’-FL的乳粉样品色谱图

2.3 线性范围、定量限及精密度

准确吸取2’-FL标准溶液，用水稀释配制成质量浓度为0.223 2，0.446 4，1.116，2.232，4.464，8.928和17.856 μg/mL的标准工作液，以2’-FL工作液峰面积为横坐标，对应工作液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=0.886 4X，相关系数R2=0.999 4，表明2’-FL在0.223 2～17.856 μg/mL范围内线性关系良好。

称取适量阴性乳粉样品，进行加标。按照1.2方法前处理后上机，测定回收率，结果得到添加量为50 mg/100 g样品平均回收率为85.7%，加标量为100 mg/100 g样品平均回收率为90.5%。当给定的加标量得到的回收率在90%～110%之间时，该加标量可以作为方法的定量限，即该方法定量限为100 mg/100 g。

准确称取3份阴性乳粉样品，选取3个加标水平，每个加标水平测定3个平行。2’-FL加标量分别为205，308和411 mg/100 g。结果得到回收率在93.98%～ 99.35%，加标回收率的SRSD为0.30%～1.65%，符合相关标准和法规在此浓度范围内的要求[21]。验证结果见表3。

表3 加标回收试验结果

2.4 实际样品检测

按照该方法的前处理和试验条件对实际乳粉样品检测测定，结果见表4。SRSD为0.92%～5.76%。说明该方法对检测实际乳粉中2’-FL具有可靠性和实用性。

表4 含有2’-FL乳粉样品测定结果

3 结论

试验建立了高效阴离子交换色谱-脉冲电化学检测法定量检测婴幼儿配方乳粉中2’-FL的方法。该方法样品预处理过程无需衍生、还原或分离纯化，操作简便，分离度高，检测结果准确，灵敏度高，适用于婴幼儿配方乳粉中2’-FL的检测分析，为精确定量婴幼儿配方乳粉中2’-FL、开发含2’-FL的婴幼儿配方乳粉提供可靠的技术支持，对工业上批量化检测2’-FL具有很好的应用价值。