动物源性食品中硝基酚钠残留量的测定

徐瑞丽，李丰，袁晓，刘姚红，杨悠，杨昌彪

1. 广电计量检测（湖南）有限公司（长沙 410007）；2. 贵州省分析测试研究院（贵阳 550002）

复方硝基酚钠（复硝酚钠、硝基酚钠）是由5-硝基邻甲氧基苯酚钠、邻硝基苯酚钠和对硝基苯酚钠按照一定比例调配而成的生长调节剂。由于硝基酚钠高效低毒，具有促根壮苗、提高产量、提高产品品质等作用[1-7]，因此作为植物生长调节剂而被广泛应用。同时，硝基酚钠也可作为饲料添加剂，用于提高肉、蛋、毛、皮等产品的产量和质量，并可预防多种疾病[8]。研究表明，硝基酚钠为弱致敏物质[9]，虽然其毒性较低[10]，但对人类健康仍具有潜在危害。2002年我国先后在中华人民共和国农业部公告第193号《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》和中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》中将硝基酚钠列为所有食品动物中的禁用药物（2019年12月27日农业农村部将禁用药物相关公告修订为中华人民共和国农业农村部公告第250号《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》）。

硝基酚钠的检测方法主要为分光光度法[11]、液相色谱法[12-13]、气相色谱法[14-16]、液相色谱串联质谱法[17-19]等。其中，分光光度法干扰较大，灵敏度较低；液相色谱法灵敏度低，而且主要为原药及饲料肥料的检测[20-22]，气相色谱法需将目标物进行衍生后测定，方法操作较繁琐。关于动物源性食品中硝基酚钠残留检测的研究较少[13,16,23-24]，而使用固相萃取-高相液相色谱串联质谱法检测动物源性食品中硝基酚钠的检测方法尚未见报道。为此，试验开发一种使用乙腈超声提取，经阴离子固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，超高效液相色谱串联质谱法检测动物源性食品中硝基酚钠残留量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5-硝基邻甲氧基苯酚钠、邻硝基苯酚钠和对硝基苯酚钠（纯度大于99%；Be Pure）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；浓氨水（25%～28%，西陇科学股份有限公司）；试验用水为一级水。阴离子固相萃取小柱（MAX，60 mg/3 mL；北京中检维康技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS）：（Xevo TQ-S Micro，配有电喷雾离子源，美国沃特世公司）；涡旋混匀器（VORTEX-6，其林贝尔仪器制造有限公司）；超声波清洗器（AS30600BT，广州利桥仪器科技有限公司）；低速离心机（LD5-2B，广州市丹安仪器仪表有限公司）；高速离心机（H1850，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 1 .0 mg/mL标准储备液

分别称取10 mg（精确到0.01 mg）5-硝基邻甲氧基苯酚钠、邻硝基苯酚钠和对硝基苯酚钠标准物质，用甲醇溶解并定容到10 mL。于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.3.2 混合标准中间溶液

用甲醇将对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠和邻硝基苯酚钠标准储备液稀释为质量浓度分别为1.0，1.0和100 mg/L的混合标准中间溶液，于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.3.3 混合标准工作溶液

根据需要，临用前吸取一定量的混合标准中间溶液，用2%甲酸甲醇-水（3∶2）溶液配制成适当浓度的混合标准工作溶液。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取

称取5.0 g（精确到0.001 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀并超声提取10 min。以4 000 r/min的转速离心5 min，取上清液于另一离心管中。用10 mL乙腈重复提取1次，合并上清液。提取液中加入4 mL氨水，涡旋混匀30 s。以8 000 r/min高速离心5 min，取上清液待净化。

1.4.2 净化

取MAX固相萃取柱置于固相萃取仪，先后用3 mL甲醇和3 mL水活化，弃去流出液。将提取液转入固相萃取小柱，以每秒1～2滴的流速使样品通过小柱，弃去流出液。依次用3 mL 5%氨水溶液，3 mL甲醇淋洗。用3 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱并收集流出液。洗脱液用水定容至5 mL，涡旋混匀，过滤膜后上机测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 液相条件

色谱柱，ACQUITY UPLC® BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；柱温35 ℃。流动相：A为5 mmol/L乙酸铵溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～2 min，90% A，2～4 min，90%～60% A；4～4.5 min，60%～10% A；4.5～7 min，10% A；7～8 min，10%～90% A；8～10 min，90% A。

1.5.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描模式，负离子扫描；监测方式，多反应监测（MRM）；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/h；碰撞气流量50 L/h；3种目标物的保留时间、母离子、子离子、去簇电压、碰撞电压等参数见表1。

表1 对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠和邻硝基苯酚钠的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 质谱条件的优化

在负离子模式下，对3种目标物分别进行母离子和子离子扫描，确定高响应特征离子对。分别优化3种目标物的毛细管电压、去簇电压、碰撞电压等参数，确定最佳仪器条件，详细参数见表1。

2.1.2 液相条件的优化

对比在使用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-乙酸铵溶液、甲醇-0.1%氨水溶液等不同体系的流动相时3种目标物的响应及分离效果。结果发现，在使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液作为流动相时，邻硝基酚钠响应特别低。使用甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相时，邻硝基酚钠响应明显增强，3种目标物峰形良好且分离度较好，3种目标物的总离子流（TIC）图见图1。

图1 混合标准溶液总离子流图

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂

硝基苯酚钠为强极性化合物，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等有机溶剂。对比甲醇、乙腈、乙腈-水、氨水乙腈等不同溶剂的提取效果。结果发现，使用乙腈作为提取溶剂时，3种目标物的提取效率最高。同时乙腈具有沉淀蛋白的作用，使用乙腈提取时，提取液较澄清易于离心分离，因此选择乙腈作为提取溶剂。在提取完成后，在提取液中加入适量氨水，使3种目标物均以阴离子形式存在。在提取液上柱时，可增强目标物与阴离子固相萃取柱中的阳离子基团的离子间作用力，从而增强目标物在小柱上的保留。

2.2.2 净化方式

5-硝基邻甲氧基苯酚钠、邻硝基苯酚钠和对硝基苯酚钠以阴离子形式存在时，可使用阴离子固相萃取柱对提取液进行净化和富集。

2.2.3 浓缩及定容

邻硝基苯酚钠在浓缩时条件比较苛刻，浓缩过程较难控制；同时浓缩操作会增强样品的基质效应，降低目标物的响应。因此选择提取液经小柱净化后，洗脱液不进行浓缩操作。同时在洗脱液中加入适量的水，以降低目标物的基质效应及样品在仪器分析时的溶剂效应。

2.3 检出限与线性范围

用2%甲酸甲醇-水（3∶2）溶液配制对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，8.0和10.0 μg/L，邻硝基酚钠质量浓度分别50，100，200，500，800和1 000 μg/L的混合标准工作溶液后上机检测。结果发现，在对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.5～10.0 μg/L质量浓度范围内，邻硝基酚钠在50～1 000 μg/L质量浓度范围内，峰面积y与分析物的质量浓度x（μg/L）均具有良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999，满足方法学要求。通过空白样品添加目标物的方法，在信噪比为3时确定3种组分的检出限。3种组分的线性回归方程、线性范围、线性系数及检出限见表2。

表2 工作曲线方程、相关系数、线性范围及检出限

2.4 回收率与精密度

对于禁用物质，分别选择检出限、2倍检出限和10倍检出限3个浓度水平进行回收率和精密度试验。分别选择猪肉（畜肉）、鸡肉（禽肉）、鱼肉（水产品）3种空白样品作为动物源性食品代表基质，进行添加回收试验。试验结果表明对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.5，1.0和5.0 μg/kg 3个添加水平的平均回收率分别为75.3%～93.9%和71.9%～93.6%，相对标准偏差分别为3.3%～14%和3.3%～5%，邻硝基酚钠在50，100和500 μg/kg 3个不同质量分数添加水平的平均回收率在64.1%～91.1%，相对标准偏差为2.8%～ 15%，详见表3。结果表明，该方法的准确度和精密度均可满足食品中药物残留分析的要求。

表3 回收率与精密度试验结果（n=6）

3 结论

建立用乙腈超声提取，阴离子固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，超高效液相色谱串联质谱法检测动物源性食品中复方硝基酚钠3种组分残留量的分析方法。结果表明，对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.5～10.0 μg/L、邻硝基酚钠在50～1 000 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠检出限为0.5 μg/kg，邻硝基酚钠检出限为50 μg/kg。对硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.5，1.0和5.0 μg/kg 3个添加水平的平均回收率分别为75.3%～93.9%和71.9%～93.6%，相对标准偏差分别为3.3%～14%和3.3%～15%，邻硝基酚钠在50，100和500 μg/kg 3个不同质量分数添加水平的平均回收率在64.1%～91.1%，相对标准偏差为2.8%～15%。该方法操作简便，回收率和精密度较好，准确度高，可用于动物源性食品中复方硝基酚钠残留量的检测。