香菇新品种“农香152”的选育*

2022-03-10 12:41李昕霖
中国食用菌 2022年2期
关键词:亲本出菇引物

李昕霖

(福建省食用菌技术推广总站,福建 福州 350003)

香菇(Lentinus edodes),别名香蕈、香菌、冬菇等,属担子菌纲(Basidiomycotina) 伞菌目(A-garicales) 口蘑科 (Tricholomataceae) 香菇属(Lentinus),是一种高蛋白、低脂肪的营养保健食品,其香气特殊,味道鲜美,营养丰富,且具有抗病毒、抗肿瘤、抗癌症、调节免疫、降血脂等多种功能,被誉为“山珍之王”[1-4]。香菇是世界上发展最快的菇类,我国又是全球主要的香菇生产国、消费国和出口国,市场潜力巨大[5]。而传统的“一家一户”粗放式栽培模式在气候要求、生长周期、生产成本、劳动强度等方面存在诸多弊端[6-7],已无法满足产业快速发展的需求,工厂化则具有实现周年生产、机械化程度高、生产成本较低等优势,顺应了现代食用菌发展的趋势。因此,培育适合工厂化栽培的香菇品种,可促进香菇工厂化的发展。

香菇属于四极性异宗结合的食用菌[8],通过品种间杂交很容易产生有结实能力的双核菌丝[9]。杂交育种的主要方法有单孢杂交、双单杂交和多孢杂交[10],目前单孢杂交育种是香菇育种中最常用的手段之一[11-13],多孢杂交方法操作简单,也可筛选出比亲本更加优良的品种[14]。香菇杂交菌株常用的鉴定技术为形态学鉴定、拮抗以及简单重复序列间扩增(ISSR)、简单重复序列(SSR)、相关序列扩增多态性(SRAP)等[15],通常采用拮抗与DNA指纹图谱相结合鉴定品种[16]。为了选育适合工厂化栽培的香菇新品种,试验采用多孢杂交技术,并结合拮抗试验和ISSR、SRAP分子技术进行杂交子的特异性鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

亲本菌株:香菇101由福建省三明市尤溪县洋中镇香菇菇农提供,香菇L18和L19由福建省龙岩市永定区农业局提供,为当地的主栽品种,香菇SK11由福建省福州市罗源县起步镇香菇菇农提供,为工厂化栽培品种。

1.2 培养基

PDA培养基:去皮马铃薯250 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g,水1 000 mL,pH自然。液体培养基:玉米粉15 g、黄豆粉10 g、葡萄糖10 g、VB110 mg、VB210 mg,水2 000 mL。栽培培养基:粗木屑30%、细木屑25%、玉米芯30%、麸皮15%、石膏1%,含水量62%,pH自然。

1.3 孢子收集

取香菇101、L18、L19和SK11成熟的子实体各3朵,切除菌柄,将菌盖朝下置于灭菌后的平皿中,于超净工作台过夜收集孢子印,孢子印放4℃冰箱保存备用。

1.4 多孢杂交

用无菌环刮取孢子印5环至5 mL无菌水,混匀后备用。取不同菌株的孢子悬浮液各100 μL混合后涂布于PDA平板进行两两菌株的多孢杂交,其中SK11是一株适合工厂栽培的菌株,因此进行了多孢自交,以期获得产量更高的杂交菌株;菌株接种各重复5皿,25℃恒温培养10 d~15 d,移取一小块菌落至新鲜的PDA平板进行纯化,并用显微观察锁状联合,有锁状联合的菌株即为杂交子。

1.5 出菇试验

配制液体培养基,取600 mL装入1 000 mL三角瓶中,经高压灭菌后备用。获得的杂交子制作试管菌种,从试管种中移取5小块接入液体培养基,25℃,160 r·min-1振荡培养7 d。采用 18 cm×35 cm×0.05 cm的聚丙烯塑料袋,使用窝口打包机装料,每袋装料湿重约1 100 g,每袋接种量约为20 mL,置于23℃~25℃菇房培养,待菌丝生理成熟后,转移至出菇房,出菇管理的主要参数为12℃~15℃、相对湿度80%~95%、二氧化碳浓度<0.1%,光照强度200 lx。记录子实体采收日期、出菇周期、产量、菌盖直径、厚度、菌柄直径及长度等数据。

1.6 品种特异性试验

1.6.1 拮抗试验

按无菌操作要求,用直径8 mm的打孔器在菌落边缘挖取菌种块,交叉接种到9 cm的PDA培养基平板上[17],两菌种间约1 cm。25℃培养,当试验品种的菌落接触后继续培养5 d~7 d,观察菌落生长和拮抗情况。

1.6.2 DNA提取

按参考文献[18]中的CTAB法提取菌株DNA。

1.6.3 ISSR分子鉴定

ISSR-PCR扩增条件和扩增体系参照参考文献[19],所选用的引物见表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 ISSR引物Tab.1 ISSR primers

1.6.4 SRAP分子鉴定

SRAP-PCR前引物Me和后引物Em相互组合成16对引物,扩增条件和扩增体系参照参考文献[20],引物统计见表2。

表2 SRAP引物Tab.2 SRAP primers

2 结果与分析

2.1 多孢杂交子获得及初筛

以福建省农作物品种审定委员会认定的香菇新品种农香2号作为对照菌株,香菇菌株杂交子的筛选结果见表3。

表3 杂交子筛选结果Tab.3 Hybridization and screening results

由表3可知,以 101×L18、101×L19、101×SK11和SK11×SK11共4个组合进行多孢杂交或多孢自交,挑起萌发的菌落269个,经镜检含有锁状联合的数量为223个,即多孢杂交子,编号为Le0001~Le0223。对获得的杂交子进行出菇试验,有97个可以正常出菇,正常出菇比例为43.5%,余下杂交子不出菇或子实体不正常。97个杂交子中16个产量高于对照菌株。

2.2 杂交菌株的复筛试验

将初筛获得的16株产量高于对照菌株的杂交子进行出菇复筛,以4个亲本和已认定的品种农香2号作对比,记录满袋时间,统计第一潮鲜菇产量、子实体的含水量等,结果统计见表4。

表4 杂交菌株出菇试验结果Tab.4 fruiting test of hybrid strains

由表4试验结果可知,杂交菌株的满袋时间在25 d~39 d;亲本菌株的菌丝在培养料上生长能力较快,5个亲本菌株中除SK11外,其余4个菌株的满袋时间均为25 d,显示出较强的菌丝活力;16个杂交子中,Le0055、 Le0059、Le0064、Le0153和Le0191菌株的满袋时间较短。在第一潮菇产量方面,亲本菌株L18、L19和SK11的产量超过200 g/袋,也显示较大的优势。仅有Le0152杂交子的产量较高,鲜菇达325 g/袋,产量远高于栽培品种;干菇重量达20.8 g/袋,也比对照高。Le0152杂交子的子实体含水量较高,为93.6%,产品可以鲜销为主。因此,对Le0152杂交子进行进一步生产性试验。

2.3 杂交子Le0152生产试验结果

对杂交子Le0152进行生产性试验,连续4批次栽培以观察其性状的稳定性,以亲本SK11和已认定的品种农香2号作对比,其生产性试验结果见表5,子实体性状见图1。

表5 农香152生产性试验结果Tab.5 Production test of Nongxiang 152

图1 农香152子实体Fig.1 Fruit body of Nongxiang 152

从表5可以看出,杂交子Le0152的产量稳定,4批次的第一潮产量均超过300 g/袋,比对照农香2号增产264.3%,比亲本SK11增产60.2%,优势显著;且其栽培周期短,从接种至第一潮采收仅69 d,比对照农香2号缩短7 d。从图1子实体朵形上看,杂交子Le0152朵形圆整,子实体厚实致密,数量多,个头较小,菌盖浅褐色至棕色;菌盖直径与厚度比亲本和对照菌株小,但其菌柄较短,菌盖直径与菌柄长度和菌柄直径的比值分别是1.49和3.96。

2.4 品种特异性试验结果

2.4.1 拮抗试验

杂交子农香152与亲本SK11及对照品种农香2号的拮抗试验结果见图2。

图2 拮抗试验Fig.2 Antagonistic experiment

由图2试验结果可知,杂交子农香152与亲本SK11及对照品种农香2号有较明显的拮抗线,认为3个菌株为不同品种。

2.4.2 ISSR和SRAP分子鉴定

从5个ISSR引物中,筛选到ISSR12和ISSR13可以将农香152与亲本SK11和对照品种农香2号相区别的DNA指纹图谱,结果见图3。

图3 农香152菌株ISSR鉴定电泳图Fig.3 Electrophoresis diagram of ISSR identification of Nongxiang 152 strain

由图3可知,引物ISSR12扩增出2个明显的条带将农香152、SK11和农香2号相互区别,同时引物ISSR13有1个条带将农香152与亲本SK11进行区分。

从16对SRAP引物组合中,筛选到Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物能将农香152与亲本SK11和对照品种农香2号相区别的DNA指纹图谱,结果见图4。

图4 农香152菌株SRAP鉴定电泳图Fig.4 Electrophoresis diagram of SRAP identification of Nongxiang 152 strain

由图4可知,引物Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物分别扩增出1个的条带将农香152、SK11和农香2号相互区别。

ISSR和SRAP多态性分析结果表明,农香152既具有与其亲本SK11相同的条带,也具有与其亲本不同的条带,表明该杂交种是亲本多孢自交后遗传物质发生重新组合得到;其与农香2号也有明显不同,表明农香152和农香2号是不同的菌株。因此,DNA分子鉴定结果表明这3个菌株各具特异性,是不同的品种。

3 结论与讨论

农香152号子实体单生,菌盖呈圆形,淡褐色,菌肉厚实致密,菌伞直径约为3.9 cm,菌盖厚约为1.5 cm,周围有部分白色鳞片,菌柄直径1.3 cm,长度2.4 cm。子实体较小,数量多,为低温出菇型品种,菌丝培养温度22℃~25℃,温度过高,菌丝体稀疏,PDA培养基上长势慢;子实体发育温度12℃~14℃,温度过高容易开伞;生物转化率达85%左右,子实体第一潮出菇集中产量高达340 g/袋,出菇周期短,未经转色可出菇,接种69 d即可采收。

试验以产量高、出菇整齐、栽培周期短、品质优良、子实体组织紧实为育种目标,筛选出性状优良、适合工厂化栽培的香菇新菌株农香152。其具有产量高,出菇周期短,不经转色即可出菇,第一潮出菇集中等突出特点,尤其适合工厂化栽培。并通过拮抗试验和ISSR、SRAP分子鉴定,确认农香152号是一个新菌株品种。为丰富和创新香菇种质资源,进一步推动香菇工厂化栽培奠定基础。

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