miR-122与急性缺血性脑卒中的相关性

王蒙蒙 王怡 林平 刘琼琼 曹平安 (大连大学附属新华医院，辽宁 大连 116000)

2016年全球总死亡人数的10.2%归因于脑卒中，成为第二大死因〔1〕。 急性缺血性脑卒中具有发病率高、不易及时被发现且有效治疗时间窗较短等特点。临床病史和神经影像学是脑卒中诊断程序的基石。虽然神经影像学可以确诊，但是敏感、快速且具有成本效益的血液检查更有助于快速识别农村地区的脑卒中，从而有助于立即转移患者进行溶栓治疗〔2〕。目前关于急性缺血性脑卒中疾病缺乏高效的血清诊断标志物〔3〕。证据表明，外周蛋白、核酸或脂质可用于确认急性缺血性脑卒中的诊断并监测疾病进展〔4〕。蛋白质生物标志物已被更广泛地研究，但灵敏度或特异性低。在血液中使用RNA作为诊断标记是一个新兴领域，其临床应用支持乳腺癌、冠状动脉疾病和传染病的诊断〔5〕。其中miRNA属于一种内源基因，由18～25 个核苷酸组成的单链RNA 分子〔6〕，目前的研究报道发现miRNA与脑血管疾病的发生发展密切相关。miRNA可分布于细胞内和血清中，其中主要稳定存于血清的外泌体中〔7〕，有可能成为新型的基因诊断标志物。miR-122可减小缺血后的梗死面积，并影响着急性缺血性脑卒中的发生发展过程，与该疾病有着紧密的联系〔8〕。因此本研究主要检测血清外泌体中miR-122的表达水平，分析其作为急性缺血性脑卒中诊断标志物的可能性。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2019年1～12月大连大学附属新华医院神经内科急性缺血性脑卒中患者的血液标本60例(男28例，女32例)为脑卒中组，同时期体检中心进行体检的健康人群血液标本40例(男20例，女20例)为对照组。其中急性缺血性脑卒中的诊断均符合中华医学会2014年的诊疗指南标准，所有受试者在症状出现后不到6 h入住神经内科，并通过CT或磁共振成像(MRI)扫描确诊。排除标准：①既往有脑卒中史；②合并严重心、肝、肾疾病及肿瘤等；③患者未行动静脉溶栓或机械取栓治疗。患者的临床基线特征，如年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症等比较，差异无统计学意义。见表1。本研究经大连大学附属新华医院伦理委员会确认，患者均知情同意且签署书面知情同意书。

表1 两组一般资料比较〔n(%)〕

1.2血液标本中miR-122表达的检测 急性缺血性脑卒中患者的血液样本在入院后24 h内抽取。并且所有健康对照样品在禁食8～12 h后收集。血液标本在采集后的30 min 内首先用离心法收集血清，离心条件为2 200 r/min，10 min，4℃。并将血清维持在-80℃直至测量。根据总外泌体分离试剂(来自血清)试剂盒的说明书提取血清中的外泌体。再通过Trizol 提取法，裂解外泌体并提取血清中的总RNA，去除RNA 中的gDNA，按照反转录试剂盒说明书逆转录全部RNA 为cDNA。反应条件：42℃孵化15 min，85℃孵化5 s。最后通过SYBR 荧光法real-time PCR 技术，按照试剂盒说明书的反应体系，检测miR-122 的表达，由公司设计合成引物序列，采用三步法的反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，55℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40个循环；熔解曲线。线虫(CEL)-39 作为内参对照，引物序列由公司设计并合成。最后使用2-ΔΔCt方法计算各组中miR-122的表达量。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验。通过受试者工作特征(ROC)曲线确定血清miR-122水平与急性缺血性脑卒中发生的相关性。

2 结 果

2.1两组血清外泌体中miR-122的表达 相较于对照组，脑卒中患者发病后1 d组血清外泌体中miR-122的表达显著升高(1.06±0.13 vs 2.20±0.31，P<0.05)；相对于对照组，急性缺血性脑卒中患者发病后7 d组血清外泌体中miR-122的表达显著升高(2.38±0.31，P<0.05)。

2.2脑卒中患者血清miR-122表达的诊断性能 见图1。

图1 血清miR-122诊断发病1、7 d急性缺血性脑卒中的ROC曲线

发病后1 d，miR-122 ROC曲线下面积0.76(95%CI：0.66～0.86)，最佳临界点为0.58，敏感性为70.00%，特异性为87.50%；发病后7 d，miR-122 ROC曲线下面积0.83(95%CI：0.75～0.91)，最佳临界点为0.63，敏感性为75.00%，特异性为87.50%，血清miR-122在急性缺血性脑卒中具有较高的诊断价值。

3 讨 论

目前在中国急性缺血性脑卒中是最常见的脑血管疾病类型〔9〕，然而迄今为止，仍然没有血液生物标志物可预测和诊断急性缺血性脑卒中。今天的诊断主要基于临床检查、MRI或CT确认，这是耗时且昂贵的。因此，迫切需要开发血清(血浆)生物标志物，以准确预测和诊断缺血性脑卒中〔10〕。

报道证明特定的循环血清miRNA在来自患有不同疾病(包括缺血性脑卒中)的患者的血清(血浆)中是高度稳定并且可检测的〔11〕。此外据报道，大概有超过20%的急性缺血性脑卒中存在miRNA的变化，因此研究者认识到miRNA与急性缺血性脑卒中的发生发展有着紧密的联系。这些研究主要是在动物模型或体外进行，很少有研究调查循环血清外泌体中miRNA的表达与急性缺血性脑卒中患者发病的相关性〔12〕。急性缺血性脑卒中患者血清外泌体中miR-122的表达在发病前与发病后有着明显的改变，而且miR-122包裹于外泌体，并分泌到体液中，可稳定的存在于血清中，所以miR-122是一种很有希望的急性缺血性脑卒中的潜在标志物〔13〕。

本研究目前还有一些局限性，样本量相对较小，需要在大型研究中进一步验证。其次，仅包括在发病后1 d和7 d收集的血液样本，但未获得有关动态改变其他时间点的信息。虽然循环血清miRNA作为生物标志物候选物在急性缺血性脑卒中疾病中很有价值，但并不足以广泛应用于临床实践〔14〕，该方法仍未标准化。最后，由于本研究的重点是临床相关性，没有完全阐明生物学机制，需要进一步的功能研究，以深入了解其来源和生物学意义。