GDC-0449在CCl4联合二乙酰氨基芴诱导肝纤维化大鼠模型中的作用

胡永红， 肖 准， 付亚东， 梁 悦， 张霖璋， 刘 伟， 慕永平，刘成海， 刘 平,3， 陈佳美

1 上海中医药大学附属曙光医院 上海市中医药研究院肝病研究所， 上海 201203；2 肝肾疾病病证教育部重点实验室 上海市中医临床重点实验室， 上海 201203；3 上海中医药大学 交叉科学研究院， 上海 201203

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段[1]，最终可致终末期肝病甚至肝细胞癌[2-3]，成为危害人类健康的主要问题之一[4]。肝纤维化病因病理机制复杂，持续性毒性损伤、代谢性障碍等造成肝细胞受损和炎性细胞浸润，激活肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)转分化为可分泌胶原的肌成纤维细胞[5]，导致肝组织内细胞外基质过度沉积而形成纤维疤痕[6]。目前已证实，抗病毒治疗可有效逆转慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎相关肝纤维化，但仍有约15%的慢性病毒感染者尽管有持续性病毒应答，而肝纤维化并无改善[7-8]；在代谢性肝病中，虽然改变生活方式或减重手术可改善纤维化组织病理学变化[9]，但尚无有效治疗非酒精性脂肪性肝病的化合药物；且在去除诱发肝内炎症反应的因素后，仍无法预防危及生命的并发症。因此，除病因治疗外，深入对肝纤维化发生发展机制的解析，找寻新的治疗靶点或开发新的治疗药物以减缓或逆转肝纤维化甚为重要。

Hedgehog信号通路是成人肝脏修复的关键调节因子，该信号通路活化由Hedgehog配体Desert Hedgehog(Dhh)、Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)结合膜受体Patched(Ptch1、Ptch2)介导，解除对跨膜转运蛋白Smoothened(Smo)的抑制，激活下游转录因子胶质瘤相关致癌基因(glioma-associated oncogene，Gli)家族(Gli1、Gli2、Gli3)，以调控细胞的增殖和分化[10]。2001年经cDNA阵列分析发现Ptch在原发性胆汁性胆管炎和原发性硬化性胆管炎患者肝组织中表达上调，首次提出Hedgehog信号通路参与肝脏疾病的发生[11]。随之，越来越多的研究报道Hedgehog信号通路参与肝纤维化过程，且其活化程度与纤维化进展和肝损伤的严重程度密切相关[10]。基于Hedgehog信号通路在肝纤维化中的重要作用，本研究旨在证实该信号通路抑制剂维莫德吉(GDC-0449)在CCl4联合二乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)诱导的肝纤维大鼠模型中的效应机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Fisher344雌性大鼠18只，体质量160～180 g，购于北京维通利华实验技术有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0011；实验动物使用许可证编号：SYXK(沪)2014-008。

1.2 试剂及药物 CCl4(货号10006480)、橄榄油(货号6918028)均购于国药集团化学试剂有限公司。2-AAF(货号A7015)购于Sigma-Aldrich上海贸易有限公司。羟脯氨酸检测试剂盒(货号A030-2-1)、HE染液试剂盒(货号D006-1-3)均购于南京建成生物工程研究所有限公司。蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(货号P1050)、山羊血清(货号C0265)、APS(货号ST005)、30% Acr-Bis(29∶1)(货号ST003)、1.5 mol/L Tris-HCl(货号ST789)、1.0 mol/L Tris-HCl(货号ST768)、10% SDS(货号ST628)均购于碧云天生物技术研究所。免疫组化试剂盒(货号GK500705)购自基因科技有限公司。总RNA提取试剂盒(Total RNA Purification Kit MagExtractor，货号NPK-201)、逆转录反应试剂盒(Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，货号FSQ-301)、SYBR Green Real Time Master Mix(货号QPK-201)均购于东洋纺(上海)生物科技有限公司。GDC-0449(货号S1082)购于Selleck公司。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备 将18只Fisher344大鼠随机分为3组，分别为正常组、CCl4/2-AAF组和GDC-0449组，每组6只。应用CCl4/2-AAF诱导肝纤维大鼠模型，模型大鼠按2 mL/kg体质量皮下注射30% CCl4-橄榄油溶液，每周2次，持续6周，以诱导肝纤维化，正常组注射等体积的橄榄油溶剂；自第7周始，注射CCl4的大鼠同时予2-AAF 100 mg·kg-1·d-1灌胃，以达到肝纤维化进展过程中抑制肝细胞增殖，促进肝祖细胞(hepatic progenitor cell，HPC)大量增殖的目的；GDC-0449组按照25 mg·kg-1·d-1灌胃干预，正常组大鼠予等体积生理盐水灌胃对照。9周末处死取材。

1.3.2 肝组织HE染色 采用肝组织石蜡切片，二甲苯及梯度酒精脱蜡，苏木素染色10 min，0.4%盐酸酒精分化，伊红染色30 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。使用Leica SCN400扫片机扫描，ImageScope软件观察肝组织病理情况。

1.3.3 肝组织天狼猩红(SR)染色及胶原阳性面积比计算 采用肝组织石蜡切片，二甲苯梯度酒精脱蜡，滴加SR染液，37 ℃孵育15 min，无水酒精分化4 s，二甲苯透明，中性树胶封片。使用Leica SCN400扫片机扫描，ImageScope软件圈选整张切片面积，得出Percent Total Positive、Total Stained Area、Total Analysis Area值，计算胶原染色面积比=Percent Total Positive × Total Stained Area/Total Analysis Area。

1.3.4 Ishak炎症活动分级标准评分[12]按照不同损伤特征进行系统性评分。(1)门管区周围或周围间隔区交界面肝炎(碎片状坏死)：0～4分；(2)融合性坏死：0～6分；(3)局灶性(斑状)溶解性坏死，凋亡及局灶性炎症：0～4分；(4)门管区炎症：0～4分。

1.3.5 羟脯氨酸(Hyp)水平测定 准确称取40～50 mg肝组织，加入水解液水解，调pH至中性，定容至10 mL，加活性炭离心，取1 mL上清加R1试剂，静置10 min，加R2试剂，静置5 min，加R3试剂，60 ℃水浴15 min，3500 r/min，离心10 min，取上清200 μL，酶标仪550 nm处测OD值。计算Hyp(μg/mg)=(测定孔OD值-空白孔OD值)/(标准孔OD值-空白孔OD值)×标准品含量(5 μg/mL)×水解液总体积(10 mL)/肝组织样品(mg)。

1.3.6 免疫组化染色 肝组织石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡，柠檬酸高温修复，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭，滴加一抗，4 ℃孵育过夜，室温复温，二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染1 min，0.4%盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。抗体信息如下：兔抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(货号ab124964)、兔抗Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)抗体(货号ab6586)、兔抗上皮细胞黏附分子(Epcam)抗体(货号ab71916)均购自艾博抗(上海)贸易有限公司；兔抗细胞角蛋白(CK)19抗体(货号10712-1-AP)、兔抗CK7抗体(货号15539-1-AP)均购自美国Proteintech公司。

1.3.7 免疫荧光共染 采用肝组织冰冻切片，预冷丙酮固定肝组织，10%山羊血清封闭，同时加入两种不同来源的一抗，4 ℃孵育过夜，室温复温，加入二抗37 ℃孵育30 min，DAPI染核，抗荧光淬灭封片液封片，荧光倒置显微镜获取图像。抗体信息如下：兔抗CK19抗体(货号10712-1-AP)购自美国Proteintech公司；鼠抗卵圆细胞标志物6(OV6)抗体(货号sc-101863)购自Santa Cruz公司。

1.3.8 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) 使用MagExtractor total RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA；采用Nano Vue浓度检测仪检测总RNA的浓度及纯度；采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒进行逆转录反应；使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix进行扩增反应，采用GAPDH校正，定量方法采用ΔΔCT法，SYBR Green两步法反应条件为：50 ℃预处理2 min，循环1次；95 ℃预变性60 s，循环1次；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，循环45次。

1.3.9 免疫蛋白印迹法(Western Blot) 采用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解肝组织，BCA法检测蛋白浓度，制备变性蛋白样本。制备丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜，封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，使用Odyssey仪器扫描成像，Image-J软件进行灰度积分值分析。抗体信息如下：兔抗α-SMA抗体(货号ab5694)购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由上海中医药大学实验动物伦理委员会审批，批号：PZSHUTCM190505002，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 GDC-0449对CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响 HE与SR染色显示，与正常组相比，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中大量胆管细胞增生、炎性细胞聚集，胶原沉积显著增加，形成明显的假小叶结构；与CCl4/2-AAF组相比，GDC-0449组肝组织中胆管细胞增生、炎性细胞聚集，胶原沉积显著减少(图1)。对SR全片阳染面积半定量分析显示，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织SR阳性染色面积比较正常组显著增加(P<0.05)，GDC-0449组大鼠肝组织SR阳性染色面积比较CCl4/2-AAF组显著下降(P<0.05)(表1)。肝组织Hyp水平测定进一步显示，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Hyp水平显著高于正常组(P<0.05)；与CCl4/2-AAF组相比，GDC-0449组大鼠肝组织中Hyp水平则显著减少(P<0.05)(表1)。Ishak评分结果显示，与正常组相比，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织Ishak评分显著增高(P<0.05)，而GDC-0449组较CCl4/2-AAF组Ishak评分显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠肝组织SR阳性染色面积比、Hyp水平及Ishak评分比较

图1 各组大鼠肝组织HE、SR染色

2.2 GDC-0449对CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠肝组织胶原表达和HSC活化的影响 免疫组化染色结果显示，与正常组相比，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Col-Ⅳ和α-SMA阳性细胞表达明显增多，GDC-0449组大鼠Col-Ⅳ和α-SMA表达则显著减少(图2)。qRT-PCR结果显示，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Col-Ⅰ、Col-Ⅳ和Acta2 mRNA表达显著升高(P值均<0.05)，而GDC-0449组肝组织中Acta2 mRNA表达较CCl4/2-AAF组则明显下调(P<0.05)(表2)。Western Blot结果显示，CCl4/2-AAF组大鼠α-SMA蛋白水平较正常组显著增多(P<0.01)，GDC-0449组α-SMA蛋白水平较CCl4/2-AAF组则明显减少(P<0.01)(图3)。

图2 Col-Ⅳ和α-SMA免疫组化染色(×200)

表2 各组大鼠肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Acta2 mRNA表达量变化

注：a，α-SMA的Western Blot结果；b，α-SMA蛋白的相对含量。图3 各组大鼠α-SMA蛋白水平

2.3 GDC-0449对CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠肝组织HPC增殖、分化的影响 免疫组化染色结果显示，与正常组相比，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中表达大量的HPC标志物Epcam，以及胆管细胞标志物CK19和CK7，GDC-0449组肝组织Epcam、CK19和CK7阳性细胞数较CCl4/2-AAF组显著减少(图4)。qRT-PCR结果显示，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Epcam、CK19、CK7和细胞周期蛋白1(Ccnd1)mRNA表达显著上调(P值均<0.05)，GDC-0449组肝组织中Epcam、CK19、CK7和Ccnd1 mRNA表达较CCl4/2-AAF组明显下调(P值均<0.05)(表3)。免疫荧光共染结果显示，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中几乎所有的CK19阳性细胞均表达HPC标志物OV6，且共表达细胞数量显著多于正常组；而与CCl4/2-AAF组相比，GDC-0449组共表达CK19与OV6的阳性细胞数显著减少(图5)。

图4 Epcam、CK19和CK7免疫组化染色(×200)

表3 各组大鼠肝组织Epcam、CK19、CK7和Ccnd1 mRNA表达水平

图5 CK19(红色)和OV6(绿色)免疫荧光共染

2.4 GDC-0449对CCl4/2-AAF大鼠肝组织Hedgehog信号通路活化的影响 qRT-PCR结果显示，与正常组相比，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Smo、Dhh、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3的表达显著升高(P值均<0.05)，予GDC-0449干预后，大鼠肝组织中Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3表达较CCl4/2-AAF组显著降低(P值均<0.05)(表4)。

表4 各组大鼠肝组织Hedgehog信号通路相关因子mRNA表达量变化

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病迁延转归的中间环节，临床研究[13]表明肝纤维化可延缓甚至可逆，因此，抗肝纤维化治疗成为治疗慢性肝病的重要环节。Hedgehog信号通路激活在受损肝脏再生修复过程中是必需的，是不同因素导致的肝脏修复与重建的共同信号通路；但过度和持续的活化会终止受损肝组织的再生修复，并促使其向肝纤维化进展[14]。本实验结果证实，在CCl4/2-AAF诱导的肝纤维化大鼠模型中，肝组织炎性细胞大量聚集，形成明显的假小叶结构，提示实验大鼠肝硬化已形成；此外，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Dhh、Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3表达较正常组显著上调，提示Hedgehog信号通路被激活。

GDC-0449是2012年首次获美国食品药品监督管理局批准用于治疗基底细胞癌的Hedgehog信号通路抑制剂[15]，可阻断细胞表面受体Ptch和Smo活性，进而抑制其下游转录因子Gli1和Gli2活化，阻断Hedgehog信号通路。研究[16]发现，GDC-0449可改善胆管结扎大鼠早期肝纤维化程度。本实验结果显示，GDC-0449可显著降低CCl4/2-AAF大鼠肝组织Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3的表达，抑制肝组织炎性细胞聚集，降低Hyp水平，减少肝内胶原阳性面积比。提示GDC-0449可显著改善CCl4/2-AAF大鼠肝组织纤维化程度。

肝纤维化进展过程涉及多种细胞的激活，HSC活化是肝纤维化发生的中心环节，是细胞外基质的主要来源。研究[17-18]发现，体外培养原代HSC活化后可表达Hedgehog配体、Hedgehog信号通路受体及其下游转录因子，且Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺(Cyclopamine)可阻抑HSC活化。本实验中，CCl4/2-AAF诱导的肝纤维化大鼠肝组织中HSC活化标志物α-SMA表达较正常组显著升高，而GDC-0449组肝组织α-SMA表达显著降低，提示GDC-0449可显著抑制HSC的活化。肝纤维化进展过程中，HSC活化后可分泌大量的细胞外基质，胶原沉积形成纤维间隔。本研究发现，随着肝纤维化进展，CCl4/2-AAF组大鼠肝组织中Col-Ⅰ、Col-Ⅳ表达明显增多；而免疫组化结果显示，GDC-0449组大鼠Col-Ⅳ表达降低。提示GDC-0449可显著抑制肝纤维化大鼠肝组织HSC的活化及胶原沉积。

HPC是具有双相分化潜能的干细胞，在肝损伤发生时，其可分化为肝细胞或胆管细胞以修复受损的肝脏。然而，在肝损伤持续存在时，Hedgehog信号通路的持续激活可诱导效应细胞之一的HPC增殖，抑制其凋亡，促使其向未成熟的上皮样细胞分化，发生“胆管反应”[19]，刺激胆管反应细胞分泌各种促纤维化因子[20]，诱导肝纤维化进展。胆管结扎后可上调肝内Hedgehog配体表达，下调配体相互作用蛋白Hhip水平，激活Hedgehog通路，进而诱导肝内胆管细胞异常增生发生胆管反应，形成胆汁性肝纤维化[21]。而将表达Ptch受体的未成熟胆管细胞与HSC共培养，发现两种细胞均能产生Hedgehog配体[22]。本实验中，CCl4/2-AAF诱导的肝纤维化大鼠肝组织中高表达HPC标志物Epcam和OV6、胆管上皮细胞标志物CK19和CK7，免疫荧光共染显示CCl4/2-AAF组肝组织中几乎所有的CK19阳性细胞均表达OV6，提示CCl4/2-AAF诱导的大鼠模型中HPC增殖，且向胆管上皮细胞分化，发生胆管反应；而GDC-0449显著抑制了纤维化大鼠Epcam、CK19、CK7以及细胞增殖标志物Ccnd1的表达，且减少了共表达OV6和CK19的阳性细胞数，提示GDC-0449可显著抑制CCl4/2-AAF肝纤维化大鼠HPC活化、增殖，并抑制其发生胆管反应。

本研究表明，GDC-0449抑制Hedgehog信号通路活化后可显著改善CCl4/2-AAF诱导的大鼠肝纤维化，且其作用机制与抑制HSC的活化、胶原沉积，阻抑HPC的活化增殖，并抑制其向胆管上皮细胞分化有关。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：胡永红参与课题设计，实施课题，撰写论文；肖准、付亚东、梁悦、张霖璋参与课题实施；刘伟参与数据收集，统计分析；慕永平、刘成海参与课题设计，实验指导；刘平、陈佳美进行课题设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。