茯砖茶优势菌株分离鉴定及发酵低级绿茶分析

赵宏朋，黄斯晨，施丽娟，王奕琦，任达兵，胡永丹，易伦朝

（昆明理工大学农业与食品学院，云南 昆明 650500）

我国盛产茶叶，云南以“茶叶的故乡”而闻名。云南种植的大叶种茶，具有芽叶肥厚、叶质柔软等优点，是制作茶产品的优良原料[1-2]。由于茶叶种植规模的不断扩大，市场上低级茶产品的存量持续增多[3-4]。低级茶产量大，品质不佳，销售价格低，严重损害了茶农和茶产业的经济效益。筛选有益菌种，采用发酵的方法改善低级茶产品质量，优化茶产品类型，将为低级茶高值化利用起到积极作用。

茯砖茶，属于发酵茶，是我国特有的黑茶品种，近几年脱颖而出，产销量一直占据黑茶市场首位，给茶产业带来了一股“金花”风。“金花”是通过“发花”工艺长成的自然益生菌体[5]。“金花”菌是茯砖茶发酵过程中的优势菌之一，对茯砖茶醇香、浓厚的风味及健康功效有重要贡献[6-7]，其分泌的多酚氧化酶、蛋白酶、水解酶等[8-10]多种酶类，为茶叶中化学物质的转化提供有利条件，是一种有利于茶叶内含物转变的益生菌。目前，“金花”菌的发酵对象多为陕西、湖南、贵州等地生产的小叶种茶，研究主要集中在其发酵特性[11]、发酵工艺[12]、生物活性[13]等方面，且对原料要求较高（一芽二三叶[14]），而针对云南大叶种茶的“金花”菌发酵研究仍鲜见报道。

本研究以湖南白沙溪茯砖茶为菌种来源，在对茯砖茶中优势菌种进行分离、纯化、鉴定的基础上，采用液态发酵方法，将纯化后的菌株用于云南大叶种低级绿茶浸提液的发酵，并对发酵前后发酵液中主要成分的含量变化进行分析。本研究可为云南大叶种低级绿茶发酵菌种的筛选及发酵工艺的优化提供理论依据，为低级绿茶的高值化利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

湖南白沙溪茯砖茶 湖南白沙溪茶厂股份有限公司；云南大叶种低级绿茶 云南省昆明市雄达茶叶市场。

咖啡碱、茶氨酸、儿茶素、表儿茶素（epicatechin，EC）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、儿茶素没食子酸酯（catechin-3-gallate，CG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin-3-gallate，GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）标准品（纯度均大于99%） 云南西力生物技术股份有限公司；氨基酸混合标准液 日本Wako公司；芦丁标准品上海源叶生物科技有限公司；磁珠法真菌基因组提取试剂盒（NMG2411） 武汉纳磁生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LCMS-8040三重四极杆液相色谱-质谱联用仪日本岛津公司；L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司；UV-6100型双光束分光光度计 上海玛帕达仪器有限公司；DYY-8C电泳仪 北京六一仪器厂；9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；PHS-3G雷磁pH计 上海精密科学仪器有限公司；Ni-U光学显微镜 日本尼康公司；AIRTECH SW-CJ-1FD医用型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：称取去皮马铃薯200 g，切片，加1 L蒸馏水，煮沸20 min，8 层纱布过滤，补加蒸馏水至1 L，加入葡萄糖20 g、琼脂20 g，121 ℃灭菌20 min。

孟加拉红培养基：称取成品孟加拉红培养基36.7 g，加入1 L蒸馏水，加热煮沸溶解，121 ℃灭菌15 min。

1.3.2 茯砖茶优势菌株的分离、纯化

称取白沙溪茯砖茶茶样25 g，于225 mL 0.85%无菌生理盐水（带玻璃珠）中；在恒温摇床中以28 ℃、180 r/min振荡20 min。振荡完成后分别稀释至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－66 个梯度，每个梯度取200 μL稀释液涂布于PDA平板上，倒置放入28 ℃恒温培养箱中培养。待菌落出现后，观察其生长情况，挑取长势较好的菌落，在PDA培养基上采用平板划线法进行分离、纯化。将纯化后的菌落转接至PDA斜面上培养5 d后保存于4 ℃冰箱中。

1.3.3 茯砖茶优势菌株的形态学鉴定

将4 ℃保存的纯化后的菌株取出，于28 ℃活化24 h，用点植法分别于PDA和孟加拉红培养基平板上28 ℃恒温培养箱中倒置培养，观察记录各培养基上菌落形态及生长情况。用乳酸酚棉蓝染色液制成水浸片，于光学显微镜下观察其个体形态和结构并成像。

1.3.4 茯砖茶优势菌株的分子生物学鉴定

参考Weiland[15]方法，用基因组提取试剂盒提取总DNA。采用真菌18S通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对所选菌株进行PCR扩增。PCR扩增体系：30 μL的总反应体系中包含上下游引物各1 μL（10 pmol）、1 μL模板DNA、15 μL Super Mix，加双蒸水补至30 μL。扩增条件：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，35 次循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。将PCR纯化产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。测序获得的ITS基因序列在NCBI数据库中使用BLAST进行同源序列比对。

1.3.5 低级绿茶浸提液的制备

参考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》[16]，按茶水比1∶30的比例称取茶叶，将茶叶用粉碎机充分粉碎后，过40 目筛，在85 ℃水浴锅中浸提30 min。茶叶浸提液经抽滤后分装在250 mL锥形瓶中，每瓶装液量100 mL。121 ℃高压灭菌20 min，冷却后备用。

1.3.6 孢子悬浮液制备

将斜面保存的不同纯化菌株于PDA平板培养基上活化2 次。在超净工作台上，用接种铲刮取3 块直径20 mm的菌落于100 mL已灭菌带有玻璃珠的无菌水内，振摇20 min，制成均匀的孢子悬浮液，通过血球计数法得到孢子悬浮液浓度为1×108CFU/mL。

1.3.7 液态发酵

取已制备好的低级绿茶浸提液，将不同菌株的孢子悬浮液分别单独加入其中，接种量均为低级绿茶浸提液体积的5%。以不加孢子悬浮液的低级绿茶浸提液作为空白实验组，于28 ℃、120 r/min摇床内培养，发酵7 d。每组3 个平行。

1.3.8 茶多酚、总黄酮、总生物碱、茶色素、可溶性固形物和pH值含量测定

参考GB/T 21733—2008《茶饮料》[17]、QB/T 5206—2019《植物饮料 凉茶》[18]、GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》[19]和文献[20-22]，发酵液中茶多酚、总黄酮、总生物碱含量分别采用酒石酸亚铁比色法、硝酸铝比色法、碱式乙酸铅紫外分光光度法进行测定。总黄酮含量标准曲线方程为：y=0.334 5x－0.006 5，R²=0.997 9；总生物碱含量标准曲线为：y=50.268x＋0.006 3，R²=0.999 1。可溶性固形物含量采用数字折光仪进行测定；pH值使用pH计测定；茶色素采用乙酸乙酯、正丁醇萃取法[23-24]测定。

1.3.9 咖啡碱、茶氨酸和儿茶素组分检测

取2 mL样品于离心管中，10 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL于烧杯中，加入4.5 mL色谱级甲醇稀释。将稀释后样品溶液过0.22 μm滤膜，加入到棕色进样瓶中，封口待测。

采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）对咖啡碱、茶氨酸和儿茶素组分进行检测。在多反应监测模式下，采用电喷雾电离源正离子模式扫描获得质谱数据，采用外标法定量。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18ODS柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为体积分数0.1%甲酸溶液，B为乙腈，流速0.2 mL/min，柱温35 ℃，梯度洗脱程序：0.01 min，90% A、10% B；10～11 min，85%～75% A、15%～25% B；11～15 min，75%～60% A、25%～40% B；15～15.01 min，60%～0% A、40%～100% B；15.01～20 min，0%～90% A、100%～10% B；20～30 min，90% A、10% B，进样量1 μL。

1.3.10 氨基酸组分检测

取1 mL样品于15 mL水解管中，加入6 mL 6 mol/L盐酸在110 ℃水解22 h后，倒入50 mL离心管中调节pH值至2.0～2.5。取4 mL水解液，在1 000 r/min离心10 min，过0.22 μm滤膜，加入棕色进样瓶中。采用氨基酸全自动分析仪进行检测，进样量20 μL，外标法定量。

1.4 数据统计与分析

显著性差异采用IBM SPSS Statistics 26.0进行分析，P＜0.05，差异显著。Origin 2018软件用于图形绘制。

2 结果与分析

2.1 茯砖茶优势菌株的分离鉴定

2.1.1 形态学鉴定结果

依据菌株的疏密、质地、颜色等形态特征差异，从茯砖茶茶样中初步分离获得4 株优势菌株，分别命名为J1、J2、J3、J4。如图1所示，菌株J1在PDA培养基上生长缓慢，形状不规则，边缘呈淡黄色，中央呈橙黄色，菌落稀松，中央隆起，少量色素扩散于培养基中；在孟加拉红培养基上生长略快，形状不规则，淡黄色至黄褐色，大量色素扩散于培养基中。菌株J2在PDA培养基上生长快，边缘呈白色至淡黄色，中央呈橄榄褐色，菌落致密，色素扩散于培养基中；在孟加拉红培养基上生长较快，中央呈黑褐色，并伴随有大量油状液滴。菌株J3在PDA培养基上生长快，整体呈淡黄色，菌落致密、平伏；在孟加拉红培养基上，中央呈淡黄褐色。菌株J4在PDA培养基上生长快，边缘稀松呈白色至橙黄色，中央呈黄褐色，菌落致密；在孟加拉红培养基上，边缘呈白色至橙黄色，中央呈淡黄褐色，平伏带略微隆起。

图1 茯砖茶中分离得到优势菌在不同培养基上的菌落形态特征Fig. 1 Colonial characteristics of the dominant fungi isolated from Fuzhuan tea cultured in different media

菌株通过染色在光学显微镜下的特征形态如图2所示，菌株J2、J3、J4均发现有性结构子囊果，子囊果呈球形或近球形，子囊果容易破裂释放出子囊孢子；菌丝均带有隔膜。菌株J1同样发现有隔菌丝，带有顶囊、分生孢子梗、足细胞等结构。根据文献[25-26]等的描述，分离得到的优势菌株J1初步鉴定为曲霉属真菌，J2、J3、J4初步鉴定为散囊菌属真菌。

图2 茯砖茶中分离得到优势菌株的细胞形态结构Fig. 2 Microscopic examination of cellular morphology of isolated strains

2.1.2ITS序列比对结果

如图3所示，4 株菌的ITS序列大小约500～750 bp，且均呈现单一、明亮的条带，表明分离得到的4 株菌DNA纯度较高、无污染。经过双向基因测序、拼接，最终获得菌株J1、J2、J3、J4的ITS序列。将4 株菌序列分别在NCBI数据库中进行同源序列搜索比对，结果表明：菌株J1序列与数据库中谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）KU20018.17（序列ID：MT487831.1）的相似度为100%；菌株J2序列与数据库中冠突曲霉（A. cristatus）HNYYWX.21（序列ID：MN759629.1）的相似度为100%；菌株J3序列与数据库中冠突曲霉DUCC5705（序列ID：MT582745.1）的相似度为100%；菌株J4序列与数据库中冠突曲霉B-TF（序列ID：MK346334.1）的相似度为100%。

图3 4 株优势菌株ITS PCR扩增产物电泳分析图Fig. 3 PCR amplification of fungal ITS from Fuzhuan tea

依据最新国际命名法规，散囊菌属已归入曲霉属曲霉组，是1 个单系的类群[27]。因此，结合形态学鉴定结果，综合鉴定菌株J1为谢瓦曲霉；菌株J2、J3、J4均为冠突曲霉。

2.2 低级绿茶浸提液发酵前后成分变化

2.2.1 茶多酚类总含量变化

图4 发酵前后茶叶浸提液中茶多酚、总黄酮、总生物碱、可溶性固形物含量和pH值变化Fig. 4 Changes in contents of tea polyphenols, total flavonoids, total alkaloids, soluble solids and pH before and after fermentation

如图4所示，经4 株优势菌单一液态发酵后，茶多酚含量显著降低（P＜0.05）。与空白对照组相比，谢瓦曲霉J1发酵液中茶多酚含量降低了78.94%，冠突曲霉J2、J3、J4发酵液中茶多酚含量分别降低了75.06%、77.06%、74.61%。结果表明，谢瓦曲霉和冠突曲霉发酵均能让云南大叶种茶中多酚类物质发生明显转化，且谢瓦曲霉的转化能力略强于冠突曲霉。茶多酚的转化可能与菌种发酵过程中分泌产生的胞外酶催化氧化、缩合以及聚合等系列反应有关[28-30]。

2.2.2 总黄酮含量变化

黄酮类化合物具有柔和的涩感，是茶叶品质的一个重要影响因子，其含量的高低与茶汤的色泽、滋味密切相关[31]。黄酮类物质的减少有助于茶汤滋味的醇化和改善茶汤色泽[32]。如图4所示，经过不同菌株发酵，与空白对照组相比，总黄酮含量分别降低了13.4%（J1）、30.6%（J2）、38.0%（J3）、33.9%（J4）（P＜0.05）。发酵液汤色由原来的暗绿淡黄逐渐变得橙黄明亮。

2.2.3 总生物碱含量变化

生物碱是茶叶中的主要活性成分之一[33]，不仅决定着茶叶的品质，还存在一定的有益作用。如图4所示，与空白对照组相比，谢瓦曲霉J1发酵液总生物碱含量略微增加，冠突曲霉J2、J3、J4发酵液降低（P＜0.05）。冠突曲霉能有效减低总生物碱含量，这与前人研究结果[34]基本一致。

2.2.4 pH值和可溶性固形物含量的变化

pH值是茶叶发酵过程稳定的一项重要参数[35]。冠突曲霉J2、J3、J4发酵液pH值与空白组接近，而谢瓦曲霉J1发酵液pH值显著降低（P＜0.05）。可溶性固形物在茶叶浸提液中的含量越高，对浸提液的纯度以及透明度的影响越大[36]。如图4所示，与空白对照组相比，通过4 株优势菌株发酵后，茶叶浸提液中可溶性固形物含量均显著降低（P＜0.05），且不同菌株之间对可溶性固形物的利用差异较小。

2.2.5 咖啡碱、茶氨酸和儿茶素含量的变化

表1 发酵前后茶叶浸提液中咖啡碱、茶氨酸和儿茶素组分含量变化Table 1 Changes in contents of caffeine, theanine and catechin in tea infusion

咖啡碱、茶氨酸和儿茶素组分是茶叶的重要呈味物质。由表1可知，与空白对照组相比，在不同菌株作用下，在茶叶浸提液中咖啡碱、茶氨酸和儿茶素含量均显著变化（P＜0.05）。咖啡碱与总生物碱的含量变化趋势一致；茶氨酸含量在冠突曲霉J2发酵液中显著减少。作为茶多酚主体成分的儿茶素，又分为酯型儿茶素与非酯型儿茶素。其中，起苦涩味作用的酯型儿茶素[37]含量均显著下降，而EC、GC、EGC 3 种具有先苦后甜滋味特征的非酯型儿茶素[37]含量均显著增加。其原因可能是在微生物作用下酯型儿茶素分解形成非酯型儿茶素[38-39]。

2.2.6 氨基酸含量的变化

氨基酸与茶汤滋味密切相关，是评价茶叶品质的重要指标[40]。由表2可知，云南大叶种低级绿茶中氨基酸组分含量在不同菌株作用下与空白对照组相比有显著变化（P＜0.05）。牛磺酸含量通过谢瓦曲霉J1发酵后显著增加，缬氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下显著增加；酪氨酸在冠突曲霉J4发酵液中未检测到。在冠突曲霉J2、J4发酵液中还未检测到胱氨酸、苯丙氨酸，这可能由于冠突曲霉J2、J4分泌苯丙氨酸解氨酶所导致[41]。对于γ-氨基丁酸，冠突曲霉J2对其影响较小，其原因可能是该菌株在发酵过程中产生谷氨酸脱羧酶，而谷氨酸脱羧酶为γ-氨基丁酸的合成酶，导致其含量变化不大[42]。

表2 发酵前后茶叶浸提液中氨基酸成分含量变化Table 2 Changes in amino acid contents before and after fermentation

2.2.7 茶色素

茶色素包括茶黄素[43]、茶红素[44]、茶褐素[45]。茯砖茶中的茶色素主要是由微生物在发酵过程中分泌的微生物酶催化产生。儿茶素在微生物胞外酶的催化下进一步氧化聚合，使茶黄素、茶红素、茶褐素积累[46]。茶多酚，主要是儿茶素，首先被氧化成醌类。醌类进一步氧化、聚合为茶黄素和茶红素，最后与其他物质（如多糖、蛋白质和咖啡碱）氧化聚合形成茶褐素[47]。茶色素的形成主要通过多酚氧化酶、过氧化物酶和漆酶三者协同作用[48]。茶色素与茶汤颜色、滋味等有密切关联，茶黄素与茶汤亮度相关[49]，而茶红素和茶褐素直接反映茶汤的口感和茶汤颜色[50]。由图5可知，与空白对照组相比，在谢瓦曲霉J1及冠突曲霉J2、J3作用下茶黄素含量显著降低，而在冠突曲霉J4作用下茶黄素含量呈显著增加。这可能由于冠突曲霉J4利用儿茶素氧化聚合形成茶黄素的速率远大于茶黄素进一步转化的速率[43]，促使茶黄素的积累。不同菌株发酵液中茶褐素含量均显著增加，茶褐素含量分别是发酵前的1.7、2.0、1.9、2.2 倍，具有显著差异（P＜0.05）。

图5 发酵前后茶叶浸提液中茶色素含量变化Fig. 5 Changes in contents of tea pigments before and after fermentation

3 结 论

对湖南白沙溪茯砖茶中的优势菌株进行分离和鉴定，分别得到谢瓦曲霉J1、冠突曲霉J2、J3和J4 4 种菌株。以云南大叶种低级绿茶为原料进行单一菌株发酵分析，发现经过4 株菌发酵后茶叶浸提液中茶多酚含量较空白对照组分别降低了78.94%、75.06%、77.06%、74.61%，总黄酮总量分别减少13.4%、30.6%、38.0%、33.9%，均显著降低；与未发酵相比，总生物碱在谢瓦曲霉J1作用下显著增加，在冠突曲霉J2、J3、J4作用下显著降低；各菌株发酵液中咖啡碱含量与总生物碱含量变化趋势相同，茶氨酸显著降低，儿茶素各组分的含量变化差异较大，其中酯型儿茶素均呈显著下降趋势，而EC、GC、EGC 3 种非酯型儿茶素均显著增加；氨基酸组分经过菌株发酵有显著变化，在谢瓦曲霉J1发酵后牛磺酸含量显著增加，缬氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下显著增加；J2、J4组中未检测到酪氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的具体原因有待进一步深入研究；茶黄素在谢瓦曲霉J1和冠突曲霉J2、J3作用下显著减少，冠突曲霉J4则显著增加；茶褐素含量均显著增加。本研究对茯砖茶优势菌株发酵云南大叶种低级绿茶后成分含量的变化进行了细致分析，可为云南大叶种低级绿茶的品质改善、茶产品类型的优化提供理论和技术依据。