六堡茶发酵前后多酚氧化酶的分离及酶学性质

龙峻瑶，黄 丽，夏 宁，滕建文，韦保耀，胡沛然

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530000）

六堡茶属黑茶类，因其产于广西苍梧县六堡镇而得名，是拥有1 500多年历史的名茶[1]。选用广西大中叶种茶树的鲜叶为原料，经过杀青、初揉、堆闷、复揉和干燥成为六堡茶毛茶，毛茶经过筛选、拼配、渥堆、汽蒸和陈化成为成品茶[2]，成品茶色泽黑褐而油润，汤色红浓且明亮，滋味醇厚回甘，有陈香味。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一类广泛分布于植物、动物和真菌等细胞内的铜结合金属蛋白酶[3]。氧气可催化PPO发生2 种反应：单酚羟基化为o-双酚和o-双酚氧化为o-醌[4]。醌继续氧化聚合成黑色素，导致组织褐变。与PPO导致果蔬中酶促褐变带来的破坏作用相反，PPO是茶树生理学与茶叶产品加工工艺学中极为重要的生物酶之一，对黑茶茶汤红褐色的色泽、醇厚的口感和陈腐风味的形成十分重要[5]。

PPO对发酵茶品质的形成至关重要，但PPO在红茶和黑茶中的来源并不相同。在红茶加工过程中，茶叶被机械破坏后释放出氧化还原酶，如PPO和过氧化物酶，它们能与儿茶素等酚类化合物相互作用形成茶黄素和茶红素，通过测定PPO活性定量监测茶黄素和茶红素，被用于红茶品质、色泽和风味的评估[6]。在黑茶中，原料毛茶的PPO在粗加工过程中可能被灭活，渥堆过程中，PPO显著增加[7]，丰富的微生物群生长繁殖分泌出新的PPO[8]，能将茶多酚转化为茶黄素和茶红素，进而转化为茶褐素，茶汤苦涩感逐渐消失，红褐色逐渐呈现，这与PPO存在着紧密联系。目前，国外已有对茶树PPO同工酶进行分离纯化和酶学性质研究的报道[9-10]，然而，国内对茶树PPO的研究还停留在粗酶的水平[11-12]，对黑茶PPO的研究也远不足，仅柴洁等[7]报道了普洱茶固态发酵过程中PPO粗酶液酶学活性研究。六堡茶渥堆过程中PPO的来源及其酶学性质不得而知，所以本研究首先分离纯化得到六堡茶毛茶和渥堆结束时期六堡茶的PPO，并进一步研究其同工酶的酶学特性，对黑茶PPO研究和黑茶加工控制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采自广西梧州中茶茶叶有限公司702016批次的六堡茶毛茶和渥堆结束时期的茶叶样品，在－20 ℃保存。

PVP30和PVP40 北京索莱宝科技有限公司；石英砂、对苯二酚、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、丙三醇、十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺、考马斯亮蓝R-250 天津市达茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

XW-80A型旋涡混合器 上海医大仪器厂；BLHH-6N型数显恒温水浴锅 上海丙林电子科技有限公司；TL-18M高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技公司；SHZ-III型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；SB-5200型超声波清洗机 上海新芝生物技术研究所；BSZ-100自动部分收集器、HD-A电脑层析采集仪、HL-2B数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂；DYY-6C电泳仪、垂直电泳板 美国伯乐公司；85-2A型恒温磁力搅拌器 常州博远实验分析仪器厂；UV-1601PC型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制：制备0.1 mol/L柠檬酸母液和0.2 mol/L磷酸氢二钠母液各1 L，按一定体积比配制为所需pH值的缓冲液。

采用文献[13]报道的方法提取PPO，并稍作修改。称取六堡茶样品1.25 g和聚乙烯吡咯烷酮0.75 g，加入pH 6.2的少量预冷磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在冰水浴下与5.0 g石英砂充分研磨，匀浆后定容至25 mL，4 ℃避光保存12 h，用4 层纱布过滤，4 ℃、8 500 r/min离心25 min，保存上清液。

1.3.2 PPO活力测定

取粗酶液0.2 mL，加入0.2 mL柠檬酸磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 5.6），1.2 mL混合反应液（0.1 mol/L柠檬酸磷酸盐缓冲液-0.1%脯氨酸-1%邻苯二酚，10∶2∶3，V/V），在37 ℃水浴30 min，加入1.2 mL 6 mol/L尿素终止反应。在460 nm波长处测定吸光度，对照组为不加邻苯二酚的混合液。根据曲线斜率测定PPO活性，单位为U/（g·min）。

1.3.3 蛋白质含量的测定

采用Bradford[14]蛋白质染料结合法，以牛血清白蛋白为标准。将0.1 mL酶液、0.9 mL蒸馏水和5 mL染料混合，加6 mL蒸馏水，在595 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 PPO的纯化

硫酸铵分级沉淀及透析：取8 mL粗酶液，加入无水(NH4)2SO4粉末，达到不同的饱和度。静置2 h后，在4 ℃、9 000 r/min离心15 min。测定上清液中PPO活性和蛋白质浓度，确定最佳的盐析方案。选择合适的盐析浓度后，将硫酸铵沉淀用pH 7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液复溶，在4 ℃、9 000 r/min离心15 min。将上清液在0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液（分子质量截止值3 500 Da）中透析16 h，用聚乙二醇浓缩酶液，并于4 ℃保存。

凝胶过滤层析：层析柱（16 mm×800 mm）用初始缓冲液（按凝胶比缓冲液3∶1的比例）配成匀浆装柱。酶液经0.2 μm滤膜过滤，然后用2～3 倍体积pH 7.2、0.2 mo1/L的磷酸缓冲液平衡柱子，将2 mL酶液上柱，用pH 7.2、0.2mol/L磷酸缓冲液进行洗脱（1 mL/min，8～10 mL/管），于波长280 nm处检测酶活性峰，然后收集有活性峰的洗脱液。测定其酶活力及蛋白浓度。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

通过SDS-PAGE分析酶纯度和分子质量。采用5%浓缩胶和12%分离胶，上样量均为10 μL，电压分别为60 V和120 V。电泳完毕，凝胶在0.1%考马斯亮蓝R-250溶液中使用摇床摇动2 h。凝胶变色，拍照保存。

1.3.6 PPO同工酶最适pH值和温度

以邻苯二酚为底物，用1.3.2节方法在pH 4.0～8.0范围内测定PPO活性。用同样的方法在20～60 ℃范围内测定PPO的最大活性。在最适温度下，PPO活性表现为相对PPO活性的残余活性百分比。

1.3.7 PPO同工酶最适底物浓度

将底物邻苯二酚分别配制成浓度为0、0.01、0.02、0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L的溶液，按照1.3.2节方法测定PPO活性。将最高酶活性记为100%，绘制相对酶活力图。

1.3.8 PPO同工酶热稳定性

将同工酶在70、80、90 ℃温度条件下分别处理0～5 min，按照1.3.2节方法测定PPO活力。最高酶活力记为100%，绘制相对酶活力图。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 粗酶液的提取

pH值对PPO的影响在于改变酶表面的电荷影响其溶解度以及破坏其结构。富含酚类的植物性原料中，PPO和酚类底物会不可逆结合影响酶的离子和疏水特性[15]，从而影响PPO的纯化效果。在本研究中，PVPP、PVP K30、PVP40被用作抑制酚类化合物和PPO结合的保护剂，研究其最佳保护剂及用量。

如图1A所示，PVP 40和PVP K30在pH 5.0～6.2范围内的酶活力均高于pH 6.2～7.0范围，并在pH 6.2时酶活力最大。其中PVP K30的最适pH 6.2，酶活力最高为157.0 U/（g·min）。如图1B所示，PVP K30对PPO的提取效果最佳。当PVP K30为0.3 g时，粗酶液的最大酶活力为136.7 U/（g·min）。PVP 40和PVPP对PPO的保护作用不明显。当PVP的加入量低时，PVP不能有效地吸附酚类物质，降低PPO活性。当PVP的添加量高时，PVP中的肽链结构可以在吸附酚类物质的同时与PPO中的Cu2＋螯合，从而影响PPO的活性。PVP含量过高，使提取物黏性过大，不利于PPO提取[16]。

如图1C所示，以0.3 g PVP K30作为保护剂液料比在10∶1～20∶1范围内酶活迅速增加，当液料比大于20∶1时，酶活增加缓慢。造成这种现象的原因可能是茶叶本身含水量极低，当液料比低时，磨茶困难，导致茶叶中的PPO不能在缓冲溶液中溶解，PPO活性低。当液料比增加时，PPO更多的溶于缓冲液中，酶活也随之增加[17-18]。当液料比增加到一定程度时，酶活趋于稳定。考虑到原料本身和后期提纯PPO，选择20∶1作为提取PPO粗酶液的液料比。

图1 保护剂对PPO活性的影响Fig. 1 Effect of protective agents on PPO activity from Liupao tea

2.2 PPO的分离纯化

图2 硫酸铵分级沉淀后上清液的蛋白含量及酶活力Fig. 2 Protein content and PPO activity of supernatant after fractional precipitation with (NH4)2SO4

经缓冲液提取的粗酶液含有大量杂质，包括杂蛋白及酚类物质，在这些物质的作用下，粗酶液的酶活会逐步降低，并发生褐变反应，使粗酶液颜色加深。硫酸铵分级沉淀法能利用不同蛋白在硫酸铵中溶解度不同的特性，去除粗酶液中的部分杂蛋白，浓缩目标蛋白，以提高分离效率。图2显示，在10%的(NH4)2SO4饱和度下，上清液中的PPO活力降低，出现蛋白质沉淀。在饱和度为70%时，酶活达到最小值。因此，选择70%的(NH4)2SO4沉淀PPO。在饱和度10%～30%时，上清液残余蛋白不断减少，而在饱和度10%～40%时，上清液残余酶活力变化不明显，说明这期间沉淀了部分杂蛋白，所以选择饱和度30%的(NH4)2SO4去除杂蛋白。之后进行Sephadex G-100凝胶过滤层析，测定洗脱液在波长280 nm处的吸光度和酶活力，得到发酵前后茶样的PPO凝胶过滤层析的结果，如图3所示。

图3 发酵前后六堡茶蛋白质Sephadex G-100凝胶过滤层析图谱Fig. 3 Sephadex G-100 gel filtration chromatogram of PPO from unfermented and fermented Liupao tea

由图3可知，六堡茶毛茶和渥堆结束茶叶的洗脱过程中都出现2 个洗脱峰，分别在第10～13收集管和第25～30收集管中。第1个洗脱峰有PPO活性，第2个洗脱峰没有PPO活性，第2个峰可能是小分子的杂蛋白，因此收集各自的洗脱峰1的洗脱液，浓缩后，进行SDS-PAGE。

2.3 SDS-PAGE结果

图4 纯化后PPO的SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE pattern of purified PPO

将纯化后的PPO进行SDS-PAGE，结果如图4所示。六堡茶毛茶中有一条分子质量约为59 kDa（命名为PPO1）的条带，发酵后的六堡茶除了具有相似的条带外，还出现了一条颜色较浅的同工酶条带，分子质量约为70 kDa（命名为PPO2）。茶树中含有多个PPO同工酶，其分子质量大小与茶叶种类有关。Teng Jie等[19]从茶叶中分离出2 种分子质量分别为85 kDa和42 kDa的PPO同工酶。张书芹等[20]报道龙井茶中PPO同工酶亚基的大小分别为53 ku和80 ku左右。刘琨[21]从碧螺春获得2 个同工酶，亚基大小分别为36 ku和42 ku。在本课题组前期研究中，比较了六堡茶和绿茶PPO的分子质量，发现绿茶中PPO分子质量在25～35 kDa之间，发酵2 d的六堡茶中PPO分子质量在48～63 kDa之间，发酵10 d的六堡茶中观察到2 条同工酶谱带，分别为48～63 kDa和63～75 kDa。在本研究中，PPO1的分子质量与绿茶接近，PPO1可能是茶树PPO，而PPO2可能是微生物在六堡茶发酵过程中产生的一种微生物源PPO。鉴于真菌在发酵过程中对茶叶品质的变化起主要作用，且大多数真菌漆酶是分子质量在59～80 kDa之间[22]，故推测PPO2是真菌漆酶。Baldrian[23]报道了白腐菌漆酶的分子质量为69 kDa。Iyer等[24]从稻瘟病菌中纯化漆酶，发现其分子质量为70 kDa，与PPO2的分子质量一致。

目前，已有相关黑茶或者植物堆肥中微生物产生PPO的报道。Mayende等[25]从堆肥中分离出能产生PPO的嗜热微生物，该微生物为Bacillussp.。Li Zhongyuan等[26]使用宏基因组和代谢组学分析表明，普洱茶中茶多酚向茶褐素的转化主要是由过氧化物酶和漆酶完成，而儿茶酚氧化酶更多存在于植物。对产生漆酶的微生物进行分析，主要是真菌如曲霉、德巴利酵母、酵母、Rasamsonia、横梗霉、Depriyomyces和少部分的细菌如假单胞菌和葡萄球菌等。Wang Qiuping等[27]从普洱茶中分离到烟曲霉，利用其将茶多酚转化为茶褐素。在本课题组的前期研究中，分离到产PPO的微生物并研究其酶量。Pantoea oleae、肺炎克雷伯氏菌和成团泛菌的产酶量均在20 U/mL以上，霉菌中的黑曲霉产量大于35 U/mL，烟曲霉大于40 U/mL，灰黄霉素大于25 U/mL，说明微生物产生的PPO对黑茶品质的转化起关键作用。

2.4 pH值和温度对PPO同工酶活性的影响

pH值可以改变氨基酸链或底物的电离状态，从而影响酶的活性[28]。在过酸过碱环境中，酶活性部位的质子异变基团的电离变化能破坏活性位点的最适环境，影响酶与底物的结合以及催化反应。此外，pH值所引起的蛋白质不可逆变性也能影响酶的催化活性。

图5 pH值（A）和温度（B）对同工酶PPO1和PPO2酶活力的影响Fig. 5 Effects of pH (A) and temperature (B) on the activities of PPO1 and PPO2

如图5A所示，PPO1和PPO2的活性在pH 4.0～8.0范围内先增大后减小，PPO1在pH 6.5时有最佳活性，PPO2在pH 6.0时有最佳活性，说明微生物产生PPO的最佳pH值小于茶叶本身PPO。该结果与已经报道的茶叶和果蔬中的研究结果接近。Altunkaya[29]报道茶叶PPO最佳pH 6.0，普洱茶发酵粗酶液中PPO最适pH 5.5[7]。Saki等[30]报道了野生食用菌中PPO最适pH 7.0，Han Qianyun等[31]从苹果中提取PPO最适pH 7.0。Iyer等[24]报道了漆酶的最适pH 6.0。六堡茶毛茶的pH值接近中性，当渥堆开始时，pH值随着发酵时间的延长会降低，使茶叶呈现弱酸性，更利于微生物PPO的释放，促进六堡茶特有品质形成。

六堡茶在渥堆过程中，为了防止温度过高导致烧堆变质，会定期翻堆散热使中心温度控制在50 ℃左右，故研究温度范围在20～60 ℃时对PPO1和PPO2活性的影响。如图5B所示，六堡茶PPO活性随温度升高而升高，达到最适温度后活性下降，PPO1的最适温度为40 ℃，PPO2的最适温度为35 ℃。目前，有研究报道了绿茶PPO在10～70 ℃最佳温度为30 ℃[6]，这与本结果PPO1的酶活力存在略微差异，主要由于六堡茶毛茶与绿茶不同，它是经过轻微发酵的茶。Allan等[32]从茄子中提取的PPO最适温度为40 ℃，Kumar等[33]报道黄曲霉在35 ℃时PPO产量最高，也说明微生物产生的PPO2在35 ℃时有较高酶活，与本研究结果相似。六堡茶在毛茶时期产生的PPO主要来自于茶叶自身，能耐受较高温度，发酵结束后，茶堆中心温度下降，微生物源PPO2的耐热性较低。

2.5 底物浓度对PPO同工酶活性的影响

图6 邻苯二酚浓度对PPO活力的影响Fig. 6 Effect of catechol concentration on PPO activity

如图6所示，邻苯二酚浓度在0～0.5 mol/L范围内，酶活力增加，当浓度达到0.5 mol/L时，PPO1和PPO2有最佳酶活力，当浓度高于0.5 mol/L时，酶活力开始下降，原因是PPO与邻苯二酚结合达到饱和从而产生抑制效果。这与谢微等[34]报道芋头中的最适底物浓度（邻苯二酚）为0.4 mol/L相似。

2.6 PPO同工酶热稳定性分析

图7 同工酶PPO1和PPO2的热稳定性曲线Fig. 7 Thermal stability curves of PPO1 and PPO2

如图7所示，PPO1在70 ℃和80 ℃经热处理一定时间后，酶活力下降，反应结束后的相对酶活力分别为59%和23%，在90 ℃时，PPO1几乎完全失活。PPO2在70 ℃处理5 min的相对酶活力降低至28%，在80 ℃和90 ℃处理5 min，几乎完全失活。说明微生物源PPO2的耐热性低于茶源PPO1。在六堡茶渥堆结束时，将进入汽蒸阶段，可将温度控制在90 ℃处理5 min，能使茶叶PPO灭活，为六堡茶加工提供理论基础。Chutintrasri等[35]表明菠萝PPO在70 ℃和80 ℃分别处理5 min时，酶活力分别下降至59%和31%，在90 ℃时，酶活力为1.2%。Li Ran等[36]测定了在75～95 ℃水烫过程中残留的菊苣叶PPO活性，表明在75 ℃处理5 min的相对酶活力为45%左右；80 ℃处理5 min的相对酶活力为32%；在90 ℃处理5 min的PPO几乎灭活。这些数据与本研究中获得的PPO1结果基本一致，表明植物源PPO的热稳定性相近，而微生物源的PPO2活性明显低于植物PPO。

3 结 论

本研究从六堡茶中分离得到2 种PPO同工酶，其中PPO1是茶树本身的PPO，PPO2是发酵过程中微生物产生的PPO，说明六堡茶在渥堆过程中是由2 种不同来源的PPO共同促进其品质形成。研究2 种同工酶的理化性质，表明微生物源PPO2的最适pH值、最适温度和热稳定性都低于茶树PPO1，这些数据有利于黑茶加工控制，为黑茶PPO的研究提供一定理论基础。但黑茶的茶树PPO和微生物源PPO对茶叶的作用机制还需要深入研究。