视网膜中央静脉阻塞伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21表达及意义

刘法，郝静，陈志杰

哈尔滨二四二医院眼三科，哈尔滨150042

摘要：目的 探究视网膜中央静脉阻塞（CRVO）伴发黄斑水肿患者房水中miR-191和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）表达及意义。方法 选取CRVO伴发黄斑水肿患者42例（42只眼）为研究对象（CRVO组），另选 取同期因白内障行超声乳化白内障吸除术患者38 例（38 只眼）作为对照组。分别采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和ELISA 法检测CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表达，采用 Logistic 回归模型分析二者与CRVO伴发黄斑水肿患者临床特征及视力预后的关系。结果 CRVO组房水中miR-191、p21 mRNA及蛋白表达均低于对照组（P 均＜0.05）。CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191 与p21 mRNA 表达呈正相关（r=0.492，P＜0.05）。CRVO伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA表达与CMT均呈负相关（r分别为-0.500、-0.432，P均＜0.05）。雷珠单抗注射次数＞4.67、缺血型、合并患有高血压、基线最佳矫正视力低水平、预后视力提高≤0.2 CRVO 患者房水中miR-191和p21 mRNA表达分别低于雷珠单抗注射次数≤4.67、非缺血型、未合并患有高血压、基线最佳矫正视力高水平、预后视力提高＞0.2 CRVO 患者（P 均＜0.05）。高血压、雷珠单抗注射次数＞4.67、缺血型、基线最佳矫正视力≤0.24、miR-191低水平是影响CRVO伴发黄斑水肿患者预后视力提高的独立危险因素（P均＜0.05）。结论 CRVO伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表达均降低，二者 与患者预后视力提高有关；二者可能协同参与CRVO伴发黄斑水肿发生发展。

关键词：视网膜中央静脉阻塞；黄斑水肿；微小RNA-191；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.020

中图分类号：R774.1文献标志码：A文章编号：1002-266X（2022）10-0080-04

视网膜中央静脉阻塞（CRVO）是一种常见的眼底血管性疾病，对患者视力损害严重。CRVO 多发于中老年人群，且随年龄增长发病率逐渐升高［1］。CRVO 发生后血液回流障碍导致视网膜出现大量无灌注区，引起黄斑水肿，是导致CRVO 患者视力损害的主要原因［2］。NAELI 等［3］研究证实，miR-191 可通过调控靶向基因在心血管疾病中发挥重要作用。ZHANG 等［4］研究发现，人脐静脉内皮细胞感染甲型流感病毒后miR-191 表达降低，与细胞通透性增加有关。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）是细胞周期重要负调控因子，有抗血管生成作用。邱梅园等［5］研究发现，上调p21表达可使视网膜色素上皮细胞阻滞于S期，抑制细胞增殖。研究表明，上调p21 表达可抑制高糖诱导的视网膜血管内皮细胞增殖活性［6］。而GU 等［7］研究表明，miR-191 是血管生成的有效抑制剂，上调miR-191 表达可促进p21 表达，影响新生血管形成。2017 年6 月—2019 年6 月，我们选取42 例CRVO 伴发黄斑水肿患者，探讨房水中miR-191、p21表达及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年6 月—2019 年6 月本院收治的CRVO 伴发黄斑水肿患者42 例（42 眼）为研究对象（CRVO 组），其中男25 例（25 眼）、女17 例（17 眼），年龄（58.47± 18.73）岁。高血压27 例，病程（2.61±0.89）个月。光学相干断层扫描（OCT）检查黄斑中央凹视网膜厚度（CMT）为（597.31 ±176.05）µm，基线最佳矫正视力0.24±0.11。缺血型CRVO 患者20 例，非缺血型CRVO 患者22 例。纳入标准：①根据眼底检查、荧光造影、OCT 检查，确诊为CRVO伴发黄斑水肿［8-9］；②初次发病，无治疗史和眼内手术史；③需行睫状体平坦部玻璃体腔药物注射治疗；④病程＞1 个月，能配合本研究，且临床资料完整。排除标准：①合并青光眼、眼内炎症、新生血管性疾病其他眼部疾病；②合并恶性肿瘤患者；③合并糖尿病者；④心、肾、肝脏功能严重不足者。另选取同期因白内障行超声乳化白内障吸除术患者38 例（38眼）作为对照组，排除标准与CRVO 组患者一致，对照组男24 例、女14 例，年龄（59.15±19.43）岁。高血压21 例。OCT 检查CMT 为（183.19±21.54）µm，基线最佳矫正视力0.22 ± 0.12。所有入组者对本研究知情并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 表达检测 入组CRVO 患者在表面麻醉和结膜囊清洁消毒后、行玻璃体腔药物注射治疗前，采用注射器针头行前房穿刺，抽取房水100 µL，置于离心管后保存于-80 ℃冰箱。入组白内障患者行超声乳化白内障吸除术前行前房穿刺，抽取房水100 µL，置于离心管后保存于-80 ℃冰箱。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 表达。TRIzol 法提取总RNA、反转录为cDNA 后用于RT-qPCR 扩增。miR-191正向引物5'-CTCTTTGGCATGGCCAATAC-3'，反向引物5'-GGTAGCTACCATGGCCCATC-3'；p21 mRNA 正向引物5'-CACTCCCAATCGGTAGGTAC-3'，反向引物5'-AATGGCAGGGCTAGGGCTGG-3'；U6 正向引物5'-GGGAGGTATGTGACTACACA-3'，反向引物5'-CAGGCCCACAGACTCATTAA-3'；GAPDH 正向引物5'-GGCATCCAGCAGCTCGATGC-3'，反向引物5' -GGACGTAACGTACGAGTAAT-3'。 反应体系为20 µL：cDNA 2 µL，正反向引物各2 µL，SYBR®Primix 10µL，ROX 0.4µL，ddH2O 3.6µL。反应步骤：95 ℃、8 min，1循环；95 ℃、15 s，62 ℃、38 s，72 ℃、15 s，以上40 个循环，1 个样品重复3 次。2-ΔΔCT法计算miR-191、p21 mRNA表达。

1.3 CRVO伴发黄斑水肿患者房水中p21蛋白表达检测 采用ELISA 法检测CRVO 组及对照组房水中p21 蛋白表达。按照人p21 蛋白ELISA 试剂盒说明书配制一系列浓度标准品，在450 nm 波长下，利用YT-MB96A 酶标仪检测不同浓度标准品的OD 值，绘制p21 蛋白的标准回归曲线，并利用回归曲线计算房水中p21蛋白表达。

1.4 随访 患者行雷珠单抗注射治疗出院后12 个月，以复查形式对其进行随访，检测并记录患者最佳矫正视力。随访期间入组42 只眼注射次数1～9（4.67±2.05）次。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以xˉ±s表示，比较行t检验；计数资料比较行χ2检验；采用Logistic 回归模型进行多因素分析，选择向前（LR）剔除法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRVO 组与对照组房水中miR-191 和p21 mRNA及蛋白表达比较 见表1。

表1 CRVO组与对照组房水中miR-191和p21表达比较（-x±s）

2.2 CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 表达与CMT 的相关性 CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191 与p21 mRNA 表达呈正相关（r=0.492，P＜0.05）。CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 表达与CMT 均呈负相关（r分别为-0.500、-0.432，P均＜0.05）。

2.3 CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191 和p21 表达与临床特征及预后关系 以平均值为界，比较各指标不同水平患者房水中miR-191 和p21 mRNA 表达差异［10］。不同性别、年龄（以平均值为界分组）、病程（以平均值为界分组）CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191和p21 mRNA表达比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）。雷珠单抗注射次数＞4.67（以平均值为界分组）、缺血型、合并患有高血压、基线最佳矫正视力低水平（以平均值为界分组）、预后视力提高≤0.2 CRVO 患者房水中miR-191和p21 mRNA 表达分别低于雷珠单抗注射次数≤4.67、非缺血型、未合并患有高血压、基线最佳矫正视力高水平、预后视力提高＞0.2 CRVO 患者（P均＜0.05），见表2。

2.4 影响CRVO 伴发黄斑水肿患者预后视力提高的危险因素分析 以本研究资料为样本，以预后视力提高水平（≤0.2 为1，＞0.2 为0）为因变量建立Logistic回归模型。以表2中P＜0.05的因素/指标为自变量，选取是否合并高血压、雷珠单抗注射次数、是否为缺血型、基线最佳矫正视力、miR-191 表达水平等5 个因素为自变量。结果如表3 所示，高血压、雷珠单抗注射次数＞4.67、缺血型、基线最佳矫正视力≤0.24、miR-191 低水平是影响CRVO 伴发黄斑水肿患者预后视力提高的独立危险因素（P均＜0.05）。

表2 房水中miR-191和p21表达与CRVO患者临床特征的关系

表3 影响CRVO伴发黄斑水肿患者预后视力提高的危险因素

3 讨论

研究表明，CRVO 可引起视网膜血管功能障碍，导致毛细血管缺血、缺氧及血管内皮细胞受损，通过引发血—视网膜屏障损坏造成血管通透性增加和血管渗漏，是CRVO并发黄斑水肿的主要原因［2］。

DU 等［11］研究报道，miR-191 在急性缺血性脑卒中患者血浆、人脐静脉内皮细胞、大脑中动脉闭塞大鼠血浆及大脑中升高，过表达miR-191 可促进人脐静脉内皮细胞凋亡，通过抑制血管生成促进缺血性脑损伤形成。研究发现，体外过表达miR-191 可抑制人肺动脉内皮细胞增殖，调节肺血管收缩和结构重建，参与肺动脉高压发生、发展［12］。本研究结果显示，CRVO 组患者房水中miR-191 表达均低于对照组，提示房水中miR-191 低表达可能与CRVO 伴发黄斑水肿发生有关，可能通过影响视网膜血管生成和通透性改变，促进CRVO 伴黄斑水肿发生。有研究表明，miR-191 在颈动脉损伤14 d 后可抑制内膜增厚，控制血管损伤后新生内膜形成［13］。本研究结果显示，CRVO 组房水中miR-191 表达与CMT 呈负相关，提示miR-191 表达降低可能与CRVO 伴发黄斑水肿患者CMT增加有关。

研究表明，缺血型、有高血压史、基线视力差（＜0.1）的CRVO 患者预后视力恢复明显较差［14-15］。TENORIO等［16］研究表明，行腹主动脉瘤血管修复术患者术前miR-191表达上调，术后6个月表达降低。本研究发现，缺血型、合并患有高血压、基线最佳矫正视力低水平、预后视力提高≤0.2 CRVO 组房水中miR-191表达低于非缺血型、未合并患有高血压、基线最佳矫正视力高水平、预后视力提高＞0.2 CRVO组患者，提示miR-191低水平可能通过影响缺血型CRVO、高血压、基线最佳矫正视力低水平发生，参与CRVO 伴发黄斑水肿进展，影响患者视力预后提高。

p21 是一种细胞周期抑制蛋白，在细胞周期系统中起负性调控作用。KE等［17］研究报道，体内外氧化应激增加可通过诱导p21 表达，促进人脐静脉内皮细胞衰老并减少增殖。SRINIVASA 等［18］研究发现，上调p21 表达可抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成。本研究结果显示，与对照组相比，CRVO组患者房水中p21 mRNA及蛋白表达降低，且与CMT 呈负相关，提示p21 mRNA 及蛋白表达下调可能与CRVO 伴黄斑水肿发生和CMT 密切相关。p21 低表达可能通过减少对血管内皮细胞增殖的抑制，促进CRVO 患者视网膜血管生成和血管渗漏发生，引起黄斑水肿。本研究还发现，CRVO 组患者p21 mRNA 表达与是否为缺血型、是否合并患有高血压及基线最佳矫正视力有关，进一步提示p21 mRNA 低表达与CRVO 伴黄斑水肿发生有关。研究发现，股浅动脉闭塞患者行血管成形术后p21表达水平明显下调，与血管平滑肌细胞增殖密切相关［19］。本研究结果显示，预后视力提高≤0.2 CRVO组患者房水中p21 mRNA 表达均低于预后视力提高＞0.2 CRVO 组患者，提示p21 mRNA 低表达可能预示CRVO伴黄斑水肿预后视力改善水平低。

本研究发现，CRVO 伴发黄斑水肿患者房水中miR-191 与p21 mRNA 表达呈正相关。提示miR-191 与p21 在参与CRVO 伴黄斑水肿发生发展中可能起协同作用，但具体机制尚需进一步探究。本研究还发现，高血压、雷珠单抗注射次数＞4.67、缺血型、基线最佳矫正视力≤0.24、miR-191 低水平是影响CRVO 伴发黄斑水肿患者预后视力提高的独立危险因素。进一步提示miR-191 与p21 表达可能与CRVO伴发黄斑水肿患者预后视力提高密切相关。

综上所述，CRVO 伴黄斑水肿患者房水中miR-191、p21 mRNA 及蛋白表达降低，与患者是否为缺血型、是否合并高血压、基线最佳矫正视力水平及预后视力提高有关，二者可能协同参与CRVO 伴发黄斑水肿发生、发展。