高效液相色谱法同时测定饮料中7种防腐剂和2种甜味剂

摘 要：目的：建立同时测定饮料中7种防腐剂2种甜味剂的高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析方法。方法：选用有代表性的果汁类饮料、碳酸饮料、含乳饮料共3种基质，用甲醇水溶液（70%）提取后，定容过滤，蛋白含量较高的样品中加入蛋白沉淀剂净化后定容过滤待上机。选用Shimadzu VP-ODS（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）色谱柱，用20 mmol/L乙酸铵和甲醇为混合流动相;检测波长为245 nm;进样量为20 μL;流速为1.5 mL/min，用优化后的色谱梯度条件进行洗脱。结果：7种防腐剂和2种甜味剂在0.5～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好（R>0.999 9），方法检出限为0.3～2.0 mg/kg，样品加标实验回收率在85.3%～98.5%，相对标准偏差为2.2%～4.5%。结论：优化后的方法简便、快速、准确和可靠，达到方法学和食品安全国家标准限量的要求，适用于饮料樣品中防腐剂和甜味剂的同时检测。

关键词：高效液相色谱法;饮料;防腐剂;甜味剂

Rapid Detection Method of Multiple 7 Preservatives and 2 Sweeteners in Beverages by High Performance Liquid Chromatography

YANG Feifan

（Shanghai Chongming Institutes for Food and Drug Control （Chongming Food Safety Testing Center）， Shanghai 202150， China）

Abstract： Objective： A High performance liquid chromatography （HPLC） method was developed for rapid determination of 7 preservatives and 2 sweeteners in beverage. Method： Fruit juice， carbonated drink and milk beverage were chosen as experiment materials. The samples were extracted by 70% methanol solution with protein precipitator. Then the liquid was analyzed by HPLC. The analytes were separated on Shimadzu VP-ODS （150 mm×

4.6 mm， 4.6 μm） column using methanol and 20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase for gradient elution at 245 nm wave length. And the injection volume was 20 μL. Result： The results showed that the 7 preservatives and 2 sweeteners had good linearity （R>0.999 9） between 0.5～50 μg/mL， the limits of detection range from

0.3 mg/kg to 2.0 mg/kg. The recoveries range from 85.3% to 98.5%. The relative standard deviations range from 2.2% to 4.5%. Conclusion： The optimized method is simple， rapid， accurate and reliable， which can meet the requirements of methodology and national food safety standards. It is suitable for the simultaneous determination of preservatives and sweeteners in beverage samples.

Keywords： high performance liquid chromatography; beverage; preservatives; sweeteners

食品添加剂是现代食品工业发展的产物，食品添加剂的使用对改善食品品质、便于食品加工及延长食品货架期具有重要作用。其中化学防腐剂由于能高效抑制食品中微生物活动、防止食品腐败变质且价廉、方便而应用广泛[1]。应用范围最广的当属酸类防腐剂中的山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸及盐类防腐剂中的山梨酸钾、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠和酯类防腐剂中的羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯[2]。甜味剂也是食品添加剂中的重要分支，合理应用甜味剂能够协调平衡食品风味、掩蔽异味、增强口感，在饮料中应用较为广泛的有糖精钠和安赛蜜。

这9种食品添加剂经常同时应用于各类饮料制品，而对以上7种防腐剂和2中甜味剂的检测方法中，现行有效的就包括《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》（GB/T 5009.140—2003）[3]、《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[4]、《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[5]及行业标准《出口乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类防腐剂的测定 高效液相色谱法》（SN/T 4262—2015）[6]这4种方法，其中样品净化、目标物提取、仪器测定条件和流动相设置等各有差异，同时测定以上项目需要人员多、时间长，工作效率低。因此近年来，检测工作者对几种食品添加剂的同时测定进行了大量研究。目前，测定防腐剂和甜味剂的方法主要有液相色谱法[7]、液相质谱联用法[8]、气相色谱法[9]和气相色谱质谱联用法[10]等，但仍然存在同时测定项目少、仪器适用性窄、成本较高等问题。为有效整合资源、提高检测速率，本文采用高效液相色谱探索一个可同时测定饮料中9种食品添加剂的检测方法，以期实现对饮料类产品中食品添加剂的高通量测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

A：果汁类、B：碳酸饮料、C：含乳饮料共3种（均为市售）。山梨酸、苯甲酸、糖精钠混合标准物质：浓度1 000 μg/mL（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司）;脱氢乙酸标准品：纯度99.5%（ChemService）;安赛蜜标准品：纯度99.40%;对羟基苯甲酸甲酯：纯度99.73%;对羟基苯甲酸乙酯：纯度99.02%;对羟基苯甲酸丙酯：纯度98.70%;对羟基苯甲酸丁酯：纯度99.90%（Dr.E）。

1.2 仪器与设备

分析天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司;离心机，赛默飞世尔科技有限公司;涡旋振荡器，赛默飞世尔科技有限公司;超声机，上海科导超声仪器有限公司;配有二级管阵列检测器的高效液相色谱仪，岛津仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 試剂配制

亚铁氰化钾（92 g/L）：称取10.6 g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，加入适量水溶解，用水定容至100 mL。

乙酸锌溶液（183 g/L）：称取22 g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3 mL冰乙酸，用水定容至100 mL。

乙酸铵溶液（20 mmol/L）：称取1.54 g乙酸铵（CH3COONH4），加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤后备用。

1.3.2 标准曲线配制

分别称取安赛蜜、脱氢乙酸标准品10 mg，用水定容至10 mL，配制成浓度为1 000 μg/mL的标准储备液;分别称取4种对羟基苯甲酸酯类10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成浓度为1 000 μg/mL的标准储备液。准确移取安赛蜜、脱氢乙酸、山梨酸苯甲酸糖精钠混合标准物质、4种对羟基苯甲酸酯类各1 mL，用水定容至10 mL，配得9种食品添加剂浓度均为100 μg/mL的混合标准中间液。分别移取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL和500 μL，用水定容至1 mL，配制得标准系列工作溶液，临用现配。

1.3.3 样品提取及净化

（1）果汁饮料。准确称取样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞塑料离心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），涡旋振荡10 min，4 000 r/min离心5 min后上清液转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

（2）碳酸饮料。将样品超声20 min除去气泡，消除定容误差和气泡对高效液相色谱的影响。准确称取样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞塑料离心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），涡旋振荡10 min，4 000 r/min离心5 min后上清液转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

（3）含乳饮料。准确称取样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞塑料离心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），涡旋振荡10 min，加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾溶液（92 g/L）1 mL和乙酸锌溶液（183 g/L）1 mL混匀，将样品在4 000 r/min离心10 min，沉淀蛋白和可溶性糖类等杂质。取上清液转移至50 mL容量瓶。于固体残渣中加入水10 mL，涡旋振荡5 min，于4 000 r/min离心10 min，将上清液转移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

1.3.4 高效液相色谱条件

色谱柱：Shimadzu VP-ODS柱（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）;二极管阵列检测器检测波长245 nm;进样量20 μL;流速1.5 mL/min。

流动相：A相为20 mmol/L乙酸铵溶液;B相甲醇（色谱纯）。通过调整两项洗脱条件，获取良好的峰形和基线分离。梯度洗脱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇/乙腈流动相体系常见于多种食品添加剂的分离。经过本试验比较，甲醇-乙酸铵溶液体系进行分离时，各组分峰型对称分布，且分离度高，实现了各目标峰之间和杂质的有效分离。同时出于检测成本及试验人员人身安全性及环境保护废弃物处理等原因，选择20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇体系。

2.2 目标化合物检测波长

利用二极管阵列检测器（Photo-Diode Array，PDA）对浓度为1 μg/mL的9种目标化合物在波长190～400 nm范围内扫描，各目标化合物最大吸收波长如表2所示。通过分析比对，在245 nm数据采集时间段内基线漂移程度较低，噪音小，且9种目标化合物响应较高，色谱图见1。因此选取245 nm作为数据采集通道。适用于配备二级管阵列检测器（Diode Array Detector/Photo-Diode Array，DAD/PDA）及可变波长紫外检测器（Variable Wavelength Ultraviolet Detector，VWD）的高效液相色谱仪对9种化合物同时分析，提高方法适用度。

2.3 方法精密度、线性关系、检出限

取浓度为1.0 μg/mL的混合标准溶液，重复进样6次。通过计算各目标峰峰面积RSD评定方法精密度，各化合物精密度在0.35～0.70%，结果表明优化后的方法稳定，可有效实现分离。用优化后的色谱条件对浓度为0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和50.0 μg/mL的标准系列工作溶液进行数据采集，以各目标峰响应与浓度绘制标准曲线，得到各自标准曲线方程。9种目标化合物在0.5～50 μg/mL线性良好，相关系数R均大于0.999 9。

根据仪器噪音3倍确定饮料中9种目标化合物的检出限在0.3～2.0 mg/kg，详见表3。

2.4 方法回收率与精密度

2.4.1 果汁饮料中7种防腐剂及2种甜味剂加标回收

取20份果汁样品，分别添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合标准溶液各6份，依照优化后的方法处理后进行数据分析。结果表明果汁中9中目标化合物的回收率在85.3%～97.8%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在2.5%～4.2%。回收率和相对标准偏差均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[11]。优化后的方法能够准确定量果汁样品中9中添加剂的含量，详见表4。

2.4.2 碳酸饮料中7种防腐剂及2种甜味剂加标回收

取20份碳酸饮料样品，分别添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合标准溶液各6份，依照优化后的方法处理后进行数据分析。结果表明果汁中9中目标化合物的回收率在88.6%～98.5%，RSD为2.7%～4.2%。回收率和相对标准偏差均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008），优化后的方法能够准确定量碳酸饮料样品中9中添加剂的含量，详见表5。

2.4.3 含乳饮料中7种防腐剂及2种甜味剂加标回收

取20份含乳饮料样品，分别添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合标准溶液各6份，依照优化后的方法处理后进行数据分析。结果表明果汁中9种目标化合物的回收率在85.6%～98.0%，RSD為2.2%～4.5%。回收率和相对标准偏差均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008），优化后的方法能够准确定量含乳饮料样品中9种食品添加剂的含量，详见表6。

3 结论

本试验探讨了高效液相色谱法同时测定饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯共9种添加剂的方法。通过对前处理方式和液相色谱分析条件的优化，实现了7种防腐剂和2种甜味剂同时测定，提高了检测效率，做到资源最大化利用。通过二极管阵列检测器多通道采集的数据进行提取分析后，选择245 nm作为唯一检测波长，使该方法同时适用于只配备紫外检测器的高效液相色谱仪，提高了方法的适用性。经过方法学验证，说明优化后的方法能够准确实现饮料样品中9中食品添加剂的定量分析，方法灵敏度好、准确度高。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）以上9种食品添加剂在果汁类饮料、碳酸饮料、含乳饮料的最大用量为25～1 000 mg/kg的规定，且以上添加剂在饮料产品中的广泛使用，因此该试验方法在饮料产品检验检测中推广实用性更强。

参考文献

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[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

作者简介：杨飞帆（1993—），男，上海人，本科，助理工程师。研究方向：食品、化妆品、饮用水等方面检验检测。