成纤维生长因子17在食管癌组织中的表达及其临床意义

张 杰，乔亚敏，林 锐

(郑州大学第一附属医院消化内科，河南 郑州 450052)

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)家族由一大类生长因子组成，分别存在于不同的多细胞生物体中[1]。FGFs家族有22个成员，通常根据其序列相似性、生化功能和进化关系分为7个亚家族[2]。典型的FGFs包括FGF1/2/5、FGF3/4/6、FGF7/10/22、FGF8/17/18和FGF9/16/20等亚家族，属于旁分泌或自分泌蛋白，结合并激活跨膜酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)，触发细胞内信号转导，介导其生物学活性[2-3]。这些生长因子是强有力的有丝分裂原，在胚胎发育、伤口愈合和细胞分化中起着重要作用[1,4-5]。FGFs在血管生成和肿瘤发生中也很重要[6-8]。本研究旨在探讨FGF17在食管癌组织中的表达水平，以及与食管癌患者临床病理表征、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般材料收集2016年1月至2021年12月在郑州大学第一附属医院行外科手术切除并经病理证实的174例食管癌患者的肿瘤组织及对应的癌旁正常食管组织(距离癌组织5 cm以上)，男142例，女32例，年龄36～82岁，中位年龄60岁，并获得患者临床分期、组织分级、淋巴结转移等临床病理特征。本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。食管癌组织芯片(HEsoS180Su08)购自上海芯超公司，由114例食管癌组织和66例相邻癌旁正常食管组织组成，患者均病理诊断为食管癌，术前未接受放、化疗等，手术时间为2006年4月至2008年12月，光镜下剔除染色效果差组织残缺不全的标本，共有106例食管癌组织和61例相邻癌旁正常食管组织纳入研究，男81例，女25例，年龄29～84岁，中位年龄66岁。

1.2 实时定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)使用RNAiso Plus(美国invitrogen公司)从食管癌组织中分离总RNA，使用Evo M-MLV RT Premix for qPCR反转录试剂预混液(批号：A2A0592；湖南艾科瑞生物工程有限公司)对RNA进行反转录，反应条件设为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit试剂盒(批号：A3A0426；湖南艾科瑞生物工程有限公司)对cDNA进行PCR反应。采用Thermo FisherABI7500 PCR仪进行RT-qPCR,每个样本设3个复孔，以3-磷酸甘油醛脱氢酶作为内源性对照。反应条件为95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 min,60 ℃ 1 min，扩增40个循环。以 2-ΔΔCt法进行数据分析，实验重复3次。FGF17基因引物序列：上游引物(F)5’-GCCCAACCTCACTCTGTGCTTAC-3’,下游引物(R)5’-TGCCACTGGTCCTGCTGTAGAG-3’。

1.3 免疫组化染色严格按照说明书进行操作步骤。将食管癌组织芯片放入烘箱，温度调至63 ℃，烘蜡1 h，后按常规方法进行脱蜡、水化、乙二胺四乙酸修复，室温下过氧化氢浸泡30 min，用加入吐温后的磷酸盐缓冲液(PBST)冲洗后滴加一抗鼠抗人FGF17单抗(批号：sc-376056；美国Santa Cruz公司)，4 ℃冰箱过夜，PBST冲洗后加二抗，37 ℃复温45 min，PBST清洗，二氨基联苯胺进行显色，苏木素复染，晾干后中性树胶封固。选择染色清晰的组织芯点进行半定量分析。

1.4 染色结果判定方法FGF17蛋白在细胞膜或细胞质中呈现棕黄色颗粒即为阳性细胞。本实验免疫组化结果参考鹿文峰等[9]的免疫组化结果评估方式，即半定量积分法，根据细胞染色强度及阳性细胞所占比例2个指标来判定染色评分。染色强度评分：无色评分为0分、淡黄色评分为1分、棕黄色评分为2分、棕褐色评分为3分。阳性细胞评分标准：阳性细胞≤5%评分为0分、>5%～25%评分为1分、>25%～50%评分为2分、>50%评分为3分。染色强度评分和阳性细胞评分相加，总分0～1分(-)，2分(+)，3～4分(++)，5～6分(+++)，(+++)和(++)认定FGF17蛋白表达阳性，(+)和(-)认定FGF17蛋白表达阴性。

2 结果

2.1 FGF17基因在食管癌组织中的表达及与患者临床病理表征的关系RT-qPCR结果显示：食管癌组织中FGF17基因表达水平(8.36±0.51)高于癌旁正常食管组织(8.07±0.44)，差异有统计学意义(t=10.850,P<0.001)；食管癌组织中FGF17基因表达水平与食管癌患者T分期、N分期有关(χ2=7.436,P=0.006;χ2=8.064,P=0.005)。见表1。

表1 FGF17基因表达与食管癌临床病理特征的关系

2.2 FGF17蛋白在食管癌组织和癌旁正常食管组织中的表达及其与预后的关系免疫组化染色结果显示：食管癌组织中FGF17蛋白阳性表达率为74.53%(79/106)，高于癌旁正常食管组织的37.70%(23/61)，差异有统计学意义(χ2=22.080,P<0.001)。FGF17蛋白高表达患者总生存率明显低于FGF17蛋白低表达患者，差异有统计学意义(χ2=7.577,P=0.006)。多因素分析结果表明，FGF17蛋白高表达是影响食管癌患者生存的独立危险因素(HR=2.084,P=0.005)。见图1、表2。

图1 不同FGF17蛋白表达食管癌患者生存曲线比较

3 讨论

食管癌是与恶性肿瘤相关的第6大致死原因[10-12]。食管癌患者发现时通常已为晚期，因此预后普遍较差，5 a生存率通常不到10%～25%[13-14]。尽管手术技术有所改善，放化疗方案和免疫治疗方案不断优化，但在过去5 a中，患者总体生存效益并没有显著改善[15-16]。因此，寻找与食管癌恶性行为相关的新的生物分子并阐明潜在的治疗靶点是一项艰巨的任务。FGF17在细胞的发育、组织修复、肿瘤生长和侵袭等过程中起重要作用。临床研究[17]表明，FGF17是疾病进展的潜在预测因子,前列腺癌组织中FGF17在基因和蛋白水平过表达，其表达与前列腺癌的Gleson Sum评分有关，且FGF17的高表达与较差的疾病特异性生存期和骨转移的存在相关性。FGF17不能在血液组织的所有正常成分中表达，但FGF17在急性白血病中表达具有高度的特异性，且与白血病的进展有关，FGF17可以成为急性白血病诊断的理想生物标志物[18]。

表2 食管癌患者生存的多因素分析结果

本研究中，RT-qPCR检测结果发现，FGF17基因在食管癌组织中高表达，且与患者的T分期、N分期有关。我们通过免疫组化染色检测FGF17蛋白在食管癌组织及癌旁正常食管组织中的表达发现，FGF17蛋白在食管癌组织中高表达，与生物信息学结果相符，且FGF17蛋白高表达患者术后总生存率显著低于FGF17蛋白低表达的患者，多因素分析结果表明FGF17蛋白高表达参与了食管癌的进展，是影响食管癌预后的独立危险因素。

总之，FGF17有望成为临床上食管癌诊断及评估预后有效的生物标志物，亦可为食管癌的治疗提供新的治疗靶点。但是，其参与调控食管癌恶性生物学行为的表征及其内在的分子机制有待进一步研究。