雷帕霉素诱导Mef2c表达促进心肌分化

程思雅 王东兴 李涛 李彦明 程冠昌✉ 翁晓菲 汪萍萍

1 河南大学临床医学院,河南 开封 475000;2湖南师范大学医学院,长沙 410013;3河南大学淮河医院 心内科,河南 开封475000

通过干细胞移植以修复损伤的心肌细胞,是心梗治疗的前沿热点。但是,目前对于干细胞心肌分化的机制所知有限,各种诱导策略并不能完全消除诱导效率较低、细胞分化混杂等问题,严重影响诱导分化效率和分化细胞均一度。

在心肌分化的进程中,有多个信号转导通路的参与,包括骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)、成纤维生长因子(FGF)、Wnt、Notch 和Hedgehog等。通过调制这些信号通路,可引导细胞定向分化为成熟的心肌细胞。文献报道体外诱导过程中可以通过BMP2、BMP4、Activin A、b FGF、FGF10、Wnt3a等分子的单一或联合应用,提高多能干细胞向心肌细胞分化的效率[1]。这些方法的局限性是诱导剂价格昂贵,不利于大规模使用。相对而言,小分子诱导剂价格便宜,同时能有效影响特定的信号通路,提高心肌分化效率,具有较好的发展前途。维生素C被发现通过激活MEK-ERK1/2信号通路促进胶原合成,进而促进心肌前体细胞的生成,有利于心肌分化[2]。诱导早期加入GSK3β抑制剂(BIO、LiCl等)、CK1激酶抑制剂CHIR99021,通过抑制GSK3β、CK1 以达到活化β-catenin介导的经典Wnt通路的作用,可以促进心肌分化[3-5]。心肌分化晚期抑制Wnt信号,使用KY02111 等新型Wnt抑制剂可提高分化心肌细胞的成熟度[6]。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

P19CL6小鼠畸胎瘤干细胞由北京大学医学部周春燕教授惠赠。DMSO、雷帕霉素和 Hoechst33342购自Sigma公司,MC1568购自Selleck公司。心肌肌钙蛋白-T(troponin-T)抗体购自Abcam公司,抗α-actinin抗体购自Sigma公司,抗Mef2c抗体购自Santa Cluz公司,抗Gapdh 抗体、辣根过氧化酶及FITC标记的二抗均购自Abclonal公司。RNAVzol试剂盒购自北京威格拉斯公司,PCR 引物由上海生工生物公司合成。

1.2 P19CL6细胞的培养及贴壁诱导分化

液氮冻存的P19CL6 细胞解冻后常规培养传代,培养于α-MEM+10%(v/v)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)+100 U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素(双抗)。将P19CL6细胞进行消化、计数,按3.7×105细胞密度用含1%(v/v)DMSO(细胞培养级)的诱导培养基接种于60 mm 的细胞培养皿内。待细胞贴壁后,每隔2天换液1次。诱导当天记为第0天(day 0)。贴壁诱导8 d后撤除DMSO,继续培养,隔天换液。

1.3 Real-time PCR

RNAVzol提取RNA 方法参照产品说明。Real-time PCR 采用TOYOBO 公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix 在ABI7700型定量PCR仪上进行。

1)反应体系。7.5μL 2×SYBR Green Master Mix buffer,0.25 μL forward primer(10 pmol/μL),0.25μL reverse primer(10 pmol/μL),1μL c DNA 模板,灭菌去离子水补足至15μL。

2)PCR 反应条件。95 ℃变性10 min,95 ℃15 s,60℃1 min,40个循环。测定样品的Ct值(Cycle threshold,循环阈值)通过计算2-△△Ct来比较不同样品之间特定基因的表达差异。

3)PCR 引物。18S基因forward primer 5′-GT A A CCCGTTGAACCCCAATT-3′,reverse primer 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′;Mef2c基因forward primer 5′-CTGAGCGTGCTGTGCGA CT GT-3′,reverse primer 5′-GCTCTCGTGCGGCTC GTTGTA-3′;Isl1基因forward primer 5′-CTGCT TTTCAGCAACTGGTCA-3′,reverse primer 5′-T AGG ACTGGCTACCATGCTGT-3′;β-Mhc 基 因forward primer 5′-ACAACCC CTACGATTAT GC GT-3′;reverse primer 5′-ACGTCAAAGGCA CTA TCCGTG-3′。

1.4 免疫荧光

分化后的细胞团加入胰酶消化,细胞滴于6孔板内的盖玻片上,待其贴壁2 h后,4%(v/v)多聚甲醛于室温固定切片15 min;0.5%(v/v)的Triton X-100/PBS(PBST)膜打孔10 min;2% BSA 37 ℃孵育30 min,以封闭非特异性结合位点;2% (v/v)BSA 稀释的抗α-actinin抗体或抗Mef2c抗体,4 ℃孵育过夜;PBST 漂洗3遍后加入TRITC标记的山羊抗小鼠二抗,湿盒内避光孵育30 min;PBST 充分漂洗后,1μg/mL Hoechst33342 核复染色5 min,漂洗后,缓冲甘油封片(PBS、甘油体积比=1∶9),置荧光显微镜(Fluoview300,Olympus)下观察。

1.5 蛋白印迹

将细胞用冰预冷的PBS洗两遍,将细胞刮下收集到Eppendorf管中,5 000 r/min离心5 min,沉淀细胞,加入预冷的裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,p H=8.0,150 mmol/L NaCl,0.1%(v/v)SDS,1% (v/v)NP-40,0.5%(v/v)脱氧胆酸钠),将细胞重悬,冰上孵育30 min后,12 000 r/min离心15 min,上清即为全细胞裂解液。BCA 法蛋白定量。30μg蛋白煮沸后,10%(v/v)SDS-PAGE 电泳转膜,5%(v/v)脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗杂交,辣根过氧化物酶标记二抗孵育后化学发光法显色。

1.6 统计方法

数据以表示,采用SPSS 24.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。P＜0.05代表差异具备显著性,标志为*;P＜0.01代表差异具备非常显著性,标志为**。

2 结果

2.1 雷帕霉素促进心肌分化

参照文献,用1%(v/v)的DMSO 诱导小鼠P19CL6畸胎瘤细胞向心肌分化。细胞汇合后以集落的方式生长,形成的“拟胚体”样结构,即发生三胚层分化[7]。通常在前4天诱导心肌分化相关转录因子表达,而后诱导心肌分化成熟基因表达。在诱导后的第8～10天,在细胞复层生长区域开始零星出现跳动的细胞群。随着继续培养,自发搏动的细胞团数目逐步增加。参考文献[8],我们采用20 nmol/L雷帕霉素(Rapa)与DMSO 联合诱导,在诱导第1～8天持续处理细胞,见图1A。在诱导分化第12天,统计产生自发搏动的拟胚体数量。如图1B 所示,雷帕霉素组显著增强了产生自发搏动的拟胚体数量。Western blot检测心肌细胞分化标志物心肌肌钙蛋白-T(troponin-T)在诱导至第12天的表达量,亦可见雷帕霉素的促进作用,见图1C。α-辅肌动蛋白(α-actinin)免疫荧光染色同样显示,雷帕霉素处理能增强成熟心肌细胞的产生,见图1D。以上研究表明,雷帕霉素能够促进心肌分化。

图1 雷帕霉素促进心肌分化

2.2 羟氯喹抑制心肌分化

由于雷帕霉素抑制m TOR 通路,从而促进细胞自噬。为了进一步阐释自噬和心肌分化的关系,我们采用自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)处理心肌诱导分化过程中的P19CL6细胞。2μmol/L 羟氯喹对细胞增殖和凋亡的影响相对较小,但严重影响了心肌分化效率,自发搏动的拟胚体数目显著降低,见图2A。Western blot同样表明羟氯喹处理抑制了心肌分化标志物心肌肌钙蛋白-T 的表达,见图2B。这些证据表明,抑制自噬会导致心肌分化受阻,进一步验证了自噬和心肌分化有重要的关联。

图2 HCQ 抑制心肌分化

2.3 雷帕霉素促进Mef2c表达

为进一步阐释雷帕霉素的效应机制,我们通过real-time PCR 检测了雷帕霉素对心肌分化转录因子Mef2c表达的影响。Mef2c是重要的心肌分化转录因子,与Gata4、Nkx2.5 等转录因子协同促进心肌前体细胞向成熟心肌的转化。如图3A 所示,在诱导分化第4、8、12 天,雷帕霉素处理组的Mef2c表达显著高于对照组。免疫荧光实验同样证实雷帕霉素处理增强了Mef2c的表达,见图3B。因此,我们的研究表明,雷帕霉素促进心肌分化早期关键基因Mef2c的表达。

图3 雷帕霉素增强Mef2c的表达

2.4 MC1568取消雷帕霉素的促进效应

MC1568是组蛋白去乙酰化酶(Hdac)Ⅱa类家族抑制剂,通过稳定Mef2-Hdac4-Hadc3相互作用,使得Mef2家族转录因子处于沉默状态,发挥抑制Mef2家族转录因子活性的作用。本项研究发现,当雷帕霉素与2μmol/L MC1568 共同处理P19CL6细胞时,可抑制分化早期(第4天)标志物Isl1的表达;在分化晚期(第8 天),可发现β肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-Mhc)表达显著受到抑制,见图4A、B。在分化第12天,MC1568联合处理组比雷帕霉素单独处理组,自发搏动的拟胚体数量大幅减少,见图4C。Western blot同样表明,MC1568处理抑制了心肌肌钙蛋白-T 的表达,见图4D。这些结果显示:Mef2c的表达和活化是心肌分化所必需的,雷帕霉素诱导Mef2c 来增强心肌分化;MC1568可能通过抑制Mef2c,从而拮抗雷帕霉素增强的心肌分化。

图4 MC1568取消雷帕霉素的促进效应

3 讨论

自噬是真核生物细胞内进化保守、广泛存在的一种应激保护机制。自噬主要指细胞经溶酶体对细胞器、长寿命蛋白质进行降解,为细胞应激、修复再生提供基本原材料,从而实现氨基酸和能量物质的再循环利用。自噬有助于清除、降解细胞内受损的或衰老的细胞器和冗余的大分子,发挥保护性作用。在缺血缺氧、营养缺失、氧化应激或感染等不良因素刺激下,细胞可启动自噬来维护自身能量和代谢稳态,但是过度的激活自噬可导致细胞的死亡。

m TOR 通路是调节自噬的重要机制。m TOR是一个丝苏氨酸蛋白激酶,m TOR 分子可以形成两个复合物——m TORC1 和m TORC2,这两个复合物分别调控不同的生物学事件,拥有不同的作用底物。m TORC1主要调控蛋白质和核糖体的生物合成、营养物质的吸收和细胞自噬等过程。m TORC2调控肌动蛋白细胞骨架的排列、细胞的存活、脂质的合成等过程。二者对雷帕霉素有着不同的敏感性,雷帕霉素抑制mTORC1 的激酶活性,然而m TORC2则对雷帕霉素不敏感。雷帕霉素是一种大环内酯类免疫抑制剂,可以抑制m TOR 信号通路的m TORC1,从而激活自噬。

除参与应激反应外,自噬与细胞的生长、发育及衰老关系密切。多个研究发现,自噬参与脂肪、血管、造血和神经分化[9-10]。已有的研究发现,m TOR通路促进胚胎干细胞自我更新,抑制向中胚层和内胚层分化。Oct4、Sox2 和Nanog是调控干细胞自我更新和未分化状态的关键转录因子,自噬参与这些重要分子的降解。因而,通过小分子化合物雷帕霉素或RNAi技术抑制m TOR,能促进Oct4、Sox2和Nanog含量降低,抑制干细胞自我更新,促进早期分化[11]。

在心脏发育的过程中,敲除自噬相关基因,会导致心脏发育障碍、异常环化、异常心室形态、瓣膜结构异常等,导致胚胎停育死亡[12]。多个研究显示,自噬与干细胞心肌分化相关。有研究显示,抑制m TORC1促进胚胎干细胞向心肌分化,m TORC2与之相反,当m TORC2活化时促进心肌方向的分化[13-14]。也有研究显示,自噬通过P53通路减少细胞分化过程中的凋亡,从而促进心肌分化[15]。自噬也能促进干性基因Nanog从细胞中清除,从而有利于心肌分化[16]。也有研究显示,自噬促进β-catenin降解,从而抑制经典Wnt通路,促进晚期心肌分化[7]。

既往的研究发现雷帕霉素能促进心肌分化关键转录因子Gata4表达[8]。在本项研究中我们发现,雷帕霉素处理促进了另一个心肌分化关键转录因子Mef2c的表达。Mef2c属于肌肉增强因子2(Mef2)家族,是Olson等在1993 年从成鼠心cDNA 文库中分离到的[17]。在转基因小鼠中删除Mef2c负责蛋白互作或DNA 结合的结构域,会导致心脏发生明显的形态学缺陷,例如心房收缩减弱、心室小梁柱缺乏、心室发育不良、心管不能形成右循环。与此同时,心脏分化的几种标志基因表达下调或不能表达。因此,Mef2 对于心肌发生和形态学形成是必要的[18]。

Mef2c与Gata4、Nkx2.5等心肌分化相关转录因子协同调控下游基因表达。Mef2c也受到乙酰化调控。MEF2C 在非激活态时,与核内的Ⅱ型Hadc4/5/7/9结合导致转录沉默。当calcineurin、Ca MK、PKD 活化后,导致Hdac4/5/7/9 磷酸化后与14-3-3结合,转移出核经泛素化降解;Mef2c得以与P300结合,得以乙酰化修饰活化,继而激活下游基因。MC1568 是Ⅱ型选择性组蛋白去乙酰化酶(Ⅱa)抑制剂,但是它可以稳定Hdac4与Mef2家族转录因子的相互作用,从而使得Mef2家族转录因子始终处于抑制状态,因此也可以被视为Mef2家族转录因子的功能抑制剂[19]。在本项研究中,我们发现雷帕霉素促进Mef2c表达。而MC1568 则能抑制雷帕霉素诱导的心肌早期和晚期分化标志基因表达。这一结果显示,雷帕霉素诱导的Mef2c表达是增强心肌分化能力所必需的。

总的来说,本研究发现通过雷帕霉素诱导自噬可以促进心肌分化关键转录因子Mef2c 表达,Mef2c的活化状态对于心肌分化效率非常重要。