黄豆酱白点的形成机理及控制技术研究

2022-05-06 07:38覃列豪周韬李敬尧廉瑞李晨京王春玲
中国调味品 2022年5期
关键词:态氮总酸白点

覃列豪,周韬,李敬尧,廉瑞,李晨京,王春玲

(天津科技大学 食品科学与工程学院,天津 300457)

黄豆酱,又名豆酱、大豆酱,是一种集调味、营养于一体的传统调味品,其营养丰富、色香味独特[1]。黄豆酱的主要原料为面粉和黄豆,加入米曲霉等微生物制成大曲,再加入一定浓度的盐水进行控温发酵制成半流动态食品[2-3]。黄豆酱含有丰富的膳食纤维、低聚糖、大豆异黄酮、皂苷、多酚等营养成分[4]。但黄豆酱在实际生产中仍存在一些问题,随着货架期的延长,通常会出现一些白点类物质,这不仅严重影响了产品的质量,而且降低了消费者的购买欲[5]。

前期的研究中认为这些白点可能是由微生物污染、酪氨酸结晶[6]、蛋白质过度水解等原因造成的,酪氨酸结晶形成主要是由于发酵过程中酶系作用于原料物质,产生氨基酸、肽等小分子物质,在后续水解反应中由于酪氨酸羧肽酶作用形成酪氨酸,随着反应进行,酪氨酸过饱和形成结晶析出。而过饱和的状态受环境的pH[7]、温度以及高温蒸煮条件下豆粕蛋白质变性程度[8]和豆粕周围渗透压环境等多种因素影响。本研究主要以黄豆酱为研究对象,对市售黄豆酱中的白点物质成分进行分析,在明确其主要成分的基础上通过优化工艺减少白点的形成,提升黄豆酱的品质。

1 材料与方法

1.1 实验原料

菌种:米曲霉沪酿3.042,由天津科技大学食品科学与工程学院提供。

1.2 试剂

草酸、乙酸、富马酸、甲酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸、乳酸:均购于北京索莱宝科技有限公司;酪氨酸:北京奥博星生物技术有限责任公司;CH4O:博欧特(天津)化工贸易有限公司。

1.3 仪器与设备

GCMS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪、LC-20A 型高效液相色谱仪 日本岛津公司;KDN-08B定氮仪 上海新家仪器有限公司;Multiskan Go酶标仪 赛默飞世尔科技公司;自动电位滴定仪 Mettler Toledo公司。

1.4 实验方法

1.4.1 白点微生物检测

挑取白点物质于无菌生理盐水中,经摇床振荡后制成悬浮液,分别向细菌和真菌培养基中加入100 μL悬浮液后均匀涂布,同时取未处理的白点物质接种于细菌和真菌培养基中,培养温度分别为30 ℃和37 ℃,同时培养3 d后观察菌落形成情况。

1.4.2 氨基酸组成分析

称取0.5 g豆酱中白点样品于烧杯中,加入少量5%三氯乙酸使其溶解,然后转移至25 mL容量瓶中,并用0.4 mol/L TCA定容,静置使白点充分溶解后用双层滤纸过滤,滤液为待测样品,参照文献[9]中的方法对氨基酸进行测定。

1.4.3 蛋白水解度测定

DH、TCA-NSI的测定参照文献[10]中的方法。

1.4.4 羧肽酶酶学性质研究

粗酶液制备、标曲绘制和酶活测定参考文献[11]中的方法。

1.4.5 理化指标测定

总酸含量的测定参照国标GB/T 12456-2008;氨基酸态氮的测定参照国标GB 5009.235-2016。

1.4.6 有机酸含量测定

有机酸标准溶液、流动相的配制、液相参数设定以及定性方法参照文献[12-13]中的方法。

1.5 分析方法

利用SPSS 19.0对数据进行分析,利用Origin软件画图。

2 结果与分析

2.1 黄豆酱白点微生物检测结果

从带有白点物质的黄豆酱中挑取出白点物质,将这些白点物质制备成悬浮液后利用营养肉汤培养基和YPD培养基培养3 d,结果显示挑取的白点物质经过细菌和真菌培养基培养后都没有菌落形成,说明黄豆酱白点不是由微生物污染造成的。

2.2 氨基酸组成分析

2.2.1 氨基酸混合标准品高效液相色谱图

将天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸等17种氨基酸的混合标准溶液进样20 L,得到混标的液相图谱,见图1。

图1 氨基酸混标图谱Fig.1 Chromatogram of amino acid mixed standard samples注:1为天冬氨酸;2为谷氨酸;3为丝氨酸;4为精氨酸;5为甘氨酸;6为苏氨酸;7为脯氨酸;8为丙氨酸;9为缬氨酸;10为甲硫氨酸;11为半胱氨酸;12为异亮氨酸;13为亮氨酸;14为苯丙氨酸;15为组氨酸;16为赖氨酸;17为酪氨酸。

2.2.2 黄豆酱白点样品液相图

黄豆酱白点经高效液相色谱分析所得结果见图2。

图2 白点样品液相图Fig.2 Liquid chromatogram of white spot samples

高效液相色谱图表明白点的主要成分是酪氨酸,占87.25%,其他氨基酸占4.44%。未能通过出峰时间匹配标准品的8.31%推测为杂质,分析其原因是白点经常出现在黄豆皮、辣椒籽等的表面,在挑取白点的时候很难避免这些杂质进入。根据上述测定结果将酪氨酸作为后续研究对象。

2.3 黄豆酱白点形成的影响因素研究

分别对有白点和无白点的黄豆酱设置3个平行,进行TCA-NSI(三氯乙酸-氮溶指数)、DH(蛋白水解度)以及酪氨酸含量显著性分析,结果见表1。有无白点黄豆酱的TCA-NSI、DH和酪氨酸含量的显著性水平P值均低于0.05,表明两种豆酱在这3种指标上均有显著性差异,可以认为黄豆酱白点的形成与TCA-NSI和蛋白质水解度有着一定关联,而且DH和TCA-NSI都代表蛋白水解的程度,酪氨酸生成和蛋白水解程度直接相关,而酪氨酸结晶会促使白点形成,因此研究蛋白水解程度为提出控制白点产生的措施提供了参考依据。

表1 有无白点黄豆酱蛋白水解度对比Table 1 The comparison of protein hydrolysis degree of soybean paste with and without white spots

2.4 羧肽酶学性质的研究

黄豆酱白点中内肽酶和外肽酶共同促使酪氨酸生成,外肽酶的作用尤其重要,外肽酶作用于酪氨酸末端,从肽链上切下酪氨酸,形成游离酪氨酸。这种外肽酶包括酪氨酸羧肽酶,具有广泛的作用位点,可以水解疏水性氨基酸[14-15]。因此,将酪氨酸羧肽酶的酶学性质研究结果作为黄豆酱发酵工艺优化的依据,对于降低酪氨酸生成十分重要。

以Z-Gly-Tyr二肽为底物,探究温度对酪氨酸羧肽酶酶活的影响,结果见图3和图4。

图3 温度对酪氨酸羧肽酶活力的影响Fig.3 The effect of temperature on the activity of tyrosine carboxypeptidase

图4 不同温度下保温不同时间对羧肽酶的影响Fig.4 The effect of different holding time at different temperatures on carboxypeptidase

由图3可知,当水浴温度为25~40 ℃时,酶活变化与温度呈现正相关的趋势,酶活随着温度的升高而上升,当温度上升至40 ℃时酶活达到最高。而当温度升高至40 ℃之后则和温度呈负相关,这可能是由于温度升高影响了酶的空间结构,使得酪氨酸羧肽酶酶活下降。因此,将发酵温度控制在25~35 ℃、40~45 ℃时酶活可以得到有效控制。

通过对该羧肽酶进行热稳定性实验,由图4可知,在25~45 ℃水浴中放置大约2 h之后,酶活仍然具有可以保持在超过70%相对酶活的能力,说明酶在此温度范围内热稳定性较好,而50 ℃水浴0.5 h后相对酶活开始下降,因此温度实验为后续选择合适的发酵温度提供了依据。

2.5 原料配比对白点产生的影响

2.5.1 不同原料配比下酪氨酸羧肽酶酶活测定

原料是黄豆酱生产的基础,选择合适的原料配比是提高黄豆酱质量的重要措施之一。蛋白质原料和淀粉质原料在微生物酶的作用下经过复杂的代谢过程形成黄豆酱的特殊风味[16]。酪氨酸羧肽酶是蛋白酶系中的一种,主要影响酪氨酸的形成,不同配比底物提供的碳源和氮源影响了微生物酶的代谢[17],势必会造成酪氨酸羧肽酶酶活的差异。黄豆与面粉按5∶5、6∶4和7∶3配比的大曲酪氨酸羧肽酶活力对比见图5,整体均呈现先上升后下降的趋势,其中36 h时酶活力达到最高,分别为335.46,329.51,264.99 U/g,3种配比中7∶3时酶活最低。

图5 不同配比下酪氨酸羧肽酶活力的变化Fig.5 Changes in the activity of tyrosine carboxypeptidase under different ratios

2.5.2 不同原料配比下理化指标测定

黄豆酱在酿造过程中,大豆中的蛋白质被微生物和各种酶作用分解成氨基酸、多肽等一类可溶性含氮化合物;面粉被分解成了各种糖类:单糖、双糖和多糖;当温度适宜时,氨基酸会和糖类物质发生美拉德反应,生成棕褐色物质。所以实验跟踪测定了黄豆酱的pH、总酸、氨基酸态氮理化指标。

2.5.2.1 总酸测定

由于在发酵过程中一些碳水化合物会被米曲霉分解产生一些有机酸,微生物细胞降解自溶后会积累游离脂肪酸,还包括各种氨基酸的生成,使得各种酸类物质不断生成,总酸含量升高[18]。而如果最终总酸含量过多,很可能是一些耐温产酸的微生物存在于酱醪中,使得总酸大量积累。过多的酸类对黄豆酱的口感也会产生不良影响,因此在实际生产中尽量避免这种情况的发生。为此,实验跟踪测定了3种原料配比下黄豆酱总酸含量。对比图6中3种原料配比,其中黄豆与面粉按7∶3配比时总酸含量最高,为1.72 g/100 g,其余两个配比总酸含量分别为1.49,1.53 g/100 g,三者皆满足了黄豆酱国标中对总酸含量≤2.0 g/100 g的要求。

图6 不同配比下发酵期间总酸含量的变化Fig.6 Changes in the content of total acids during fermentation under different ratios

2.5.2.2 pH测定

由图7可知,随着发酵的进行,pH呈现下降趋势,前期下降速度快,后期基本持平。pH出现变化的原因和总酸类似。3种配比下发酵终端pH分别降低至4.88,4.95,4.80,均在正常发酵范围内。

图7 不同配比下发酵期间pH的变化Fig.7 Changes in pH values during fermentation under different ratios

2.5.2.3 氨基酸态氮含量的测定

氨基酸态氮主要指以氨基酸状态存在的氮元素含量,是国标中评价黄豆酱质量的重要指标之一[19]。氨基酸的生成丰富了黄豆酱的风味,如天冬氨酸和谷氨酸构成了黄豆酱的鲜味,除此之外,还含有甜味、酸味、苦味氨基酸[20]。

由图8可知,大豆含量越高,氨基酸态氮含量越高。在整个发酵过程中,不同原料配比的黄豆酱氨基酸态氮含量均呈上升趋势,配比为7∶3的氨基酸态氮含量最高,黄豆酱发酵10 d后上升缓慢是由于一部分氨基酸态氮与还原糖发生了羰氨反应,使得部分氨基酸态氮被消耗。由于生成量大于消耗量,所以氨基酸态氮还处于上升趋势,发酵终端各原料配比的氨基酸态氮含量分别为0.67,0.78,0.81 g/100 g,满足了黄豆酱国标中对氨基酸态氮含量≥0.5 g/100 g的要求。

图8 不同配比下发酵期间氨基酸态氮含量的变化Fig.8 Changes in amino acid nitrogen content during fermentation under different ratios

3 结论

根据微生物检测结果可知白点不是由于微生物污染造成的。经高效液相色谱分析,测得白点物质含有17种氨基酸,其中酪氨酸占87.25%,所以可以判断白点物质的主体物为酪氨酸。对黄豆酱白点性质研究结果显示,有白点的黄豆酱蛋白水解度明显高于无白点的黄豆酱,酪氨酸含量也较高,二者之间存在显著关联,因此推测白点的生成与蛋白过度水解有一定的关系。羧肽酶酶学性质研究结果表明,当温度在30~35 ℃、40~45 ℃时酶活较低,并且相对酶活在3 h内仍能够保持在70%以上,黄豆与面粉按7∶3配比时酶活最低,该配比下发酵终端总酸1.72 g/100 g满足黄豆酱国标中总酸含量≤2.0 g/100 g的要求;pH 4.8在黄豆酱正常发酵范围内;氨基酸态氮0.81 g/100 g满足黄豆酱国标氨基酸态氮含量≥0.5 g/100 g的要求,且在3种配比下含量最高,终端酱醪未发现白点类物质生成。

猜你喜欢
态氮总酸白点
医 学 指甲上有小白点是缺钙吗?
粉刷匠的孩子,真让我羡慕
消除大型锻件内白点缺陷的工艺方法浅析
刷子李
蚕豆酱醅天然发酵过程中理化指标变化的分析研究
海鲜菇氨基酸态氮负压提取工艺优化研究
不同氮水平下秸秆、生物质炭添加对旱作农田土壤酸解有机氮组分的影响
不同颜色余甘子果实发育过程中5种生理指标的变化及其相关性
食品中总酸的测定方法确认报告
选择酱油有窍门