稳心颗粒对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43和内质网应激通路基因表达的影响△

吕梦，纪晓迪，刘珂珂，娄利霞，聂波，赵久丽，吴爱明

北京中医药大学 东直门医院/中医内科学教育部和北京市重点实验室，北京 100700

流行病学报告显示，中国心血管病的患病率处于持续上升阶段，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位[1]。冠心病在心血管疾病的临床死亡原因中居首位，心肌梗死是冠心病中一种严重疾病类型，而由心肌梗死继发的快速型室性心律失常可导致心源性猝死的发生[2]。缝隙连接是心肌细胞间进行电、化学偶联的跨膜通道，维持心肌细胞间正常的电传导及节律性收缩等功能，心梗后缝隙连接蛋白的异常导致心脏电传导障碍，最终导致心律失常[3]。心肌缺血缺氧坏死，可刺激内质网应激发生[4]，活化内质网膜上感应分子肌醇需求激酶1（IRE1）和活化转录因子6（ATF6），进而启动未折叠蛋白反应，而X盒结合蛋白-1（XBP-1）转录因子的表达由ATF6 及IRE1 两条途径活化，通过调节内质网伴侣基因蛋白如葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达，加强未折叠蛋白质的折叠及降解[5-6]，有研究表明内质网的功能与蛋白质的降解途径相关[7]，内质网过度应激可能影响缝隙连接蛋白的代谢稳态。

稳心颗粒由党参、黄精、三七、琥珀、甘松5味药组成。《中成药治疗优势病种临床应用指南》中已明确指出，稳心颗粒用药4 周可改善心悸、胸闷等临床症状[8]，前期研究表明稳心颗粒可通过调控过度内质网应激改善心肌梗死大鼠心脏病理状态[9]，且内质网应激凋亡途径对心肌细胞缝隙连接蛋白43（CX43）表达的影响已在心肌细胞H9c2 实验中验证[10]，而本研究通过进一步的动物实验，从基因的角度明确稳心颗粒改善心律失常的内在机制。通过建立心肌梗死大鼠模型，探索心肌梗死后心律失常的病理状态下，稳心颗粒对缝隙连接蛋白及内质网应激通路的影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。通过东直门医院实验动物伦理委员会审批后（审批号：17-12-01），饲养于北京中医药大学东直门医院重点实验室屏障环境动物室。

1.2 试药

酒石酸美托洛尔片（25 mg/片，阿斯利康制药有限公司，批号：2006A49）；稳心颗粒（5 g/袋，山东步长制药有限公司，批号：1909042）；盐酸异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）注射液（2 mL，西南药业股份有限公司，批号：200901）；Trizol 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，批号：50175111）；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRTPCR）扩增试剂盒（美国ABI公司，批号：2012607）；CX43 抗体（艾博抗贸易有限公司，批号：GR3271571-13）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Proteintech 中国公司，批号：10015666）；4%组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20190718）；苏木素-伊红（HE）染色液（批号：P20200318）、快速Masson 染液试剂盒（批号：20190706）均购于南京建成科技有限公司；二甲苯（批号：20210115）、无水乙醇（批号：20200118）均购于天津大茂化学试剂厂；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20060401）。

1.3 仪器

BL-420S 型生物机能实验系统（成都泰盟软件有限公司）；RM2235 型石蜡切片机、HII220 型石蜡烤片机（德国徕卡公司）；ALC-V8S 型小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；FX-7202 型多道自动分析心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司）；Mx3000P 型Real-time PCR 仪（美国安捷伦Stratagene 公司）；5424R 型台式低温高速离心机（德国艾本德公司）；LF-2000 型电泳仪（北京龙方科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型制备

采用心脏左冠状动脉前降支结扎法制备心肌梗死大鼠模型[11]，结扎后可观察到结扎线下左室前壁缺血变白，术后即刻心电图检测ST段显著抬高。

2.2 分组及给药

参考文献[12]的心肌梗死大鼠入组标准，以心肌梗死术后24 h 前壁V3-V6、侧壁Ⅰ、AVL 导联，同时兼有前间壁V1 或V2 导联检测到病理性Q 波为造模成功标准。随机分为模型组，稳心颗粒低、高剂量组，美托洛尔组，另设只穿线不结扎冠状动脉的假手术组作为对照，每组8 只。稳心颗粒和美托洛尔的给药剂量按照文献[13]中等效剂量换算方法，稳心颗粒低剂量组（1.35 g·kg-1）、美托洛尔组（2.25×10-3g·kg-1）采用等效剂量，稳心颗粒高剂量组（2.70 g·kg-1）为低剂量组的2倍。假手术组及模型组均给予0.9%氯化钠溶液。术后第2 天开始灌胃给药，每日1次，连续治疗2周后，检测相应指标。

2.3 ISO诱导心律失常

连接BL-420S 型生物机能实验系统，USB 连接电源，大鼠麻醉仰卧位固定，连接在体心电图，启动BL-420软件，选择菜单“输入信号/通路1/心电”后，出现心电图波形，待波形稳定后，按1.28 mg·kg-1腹腔注入ISO[14]，观察并记录5 min 内各组出现心律失常的大鼠数量。

2.4 导管法血流动力学检测

灌胃给药2 周后，腹腔麻醉大鼠，仰卧位固定，颈部正中备皮消毒，沿颈正中线切开，分离肌群，暴露右颈总动脉，结扎远心端，近心端打结后用动脉夹夹住。在右颈总动脉上作一1.5 mm 左右的切口，将导管用肝素钠溶液冲灌后插入动脉，向心脏方向推进，直到进入左心室。待信号稳定5 min后检测以下指标：左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）[9]。

2.5 HE染色

药物治疗2 周后，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠取心脏组织，放入4%组织细胞固定液中固定，经过脱水、透明、石蜡包埋后制成石蜡切片。将制作好的石蜡组织切片置于烤片机上60 ℃烘烤1 h，先后放入3 个盛有新鲜二甲苯的缸中各15 min，依次放入盛有体积分数为100%、95%、90%、80%、70%乙醇的缸中各2 min 脱蜡，自来水冲洗5 min，细胞核用苏木素染色8 min，自来水冲洗5 min后，1%盐酸乙醇（浓盐酸1 mL+70%乙醇100 mL）分化40 s，自来水中冲洗返蓝10 min，细胞质用伊红溶液染色8 min，自来水冲洗3 min 后，再依次放入盛有体积分数为70%、80%、90%、95%、100%乙醇的缸中各1 min 脱水，之后分别放入3 个盛有新鲜二甲苯的缸中各10 min，中性树胶于通风橱内封片[15]。

2.6 Masson染色

石蜡切片制作及脱蜡过程同2.5 项下方法，染色前蒸馏水湿润玻片，根据染色试剂盒说明书操作，使用试剂盒内核染液染色60 s，冲洗液冲洗，浆染液染色50 s，冲洗液冲洗，分色液分色8 min 之后直接用复染液染色5 min，无水乙醇冲洗，吹干后封片。使用ImageJ v1.8.0 软件分析胶原纤维容积分数，按公式（1）计算。每组选取8 张切片，每张切片采集3个不重叠视野进行统计分析。

2.7 qRT-PCR检测

取大鼠心肌梗死边缘区组织，Trizol法提取心肌组织总RNA[16]。测定260 nm 处和280 nm 处吸光度（A）的比值衡量蛋白质污染程度，1.8＜A260/A280＜2.1为高质量RNA，并按公式（2）计算各样本RNA 终质量浓度（ng·μL-1）。

式中n为稀释倍数。配制反转录反应体系，进行qRT-PCR。扩增条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环40次[17]。以GAPDH 为内参，CX43、GRP78、IRE1、ATF6、XBP1 mRNA 的相对表达量按照2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.8 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测

参考文献[18]中的实验技术，取各组大鼠梗死边缘区心肌组织20 mg左右，RIPA裂解液冰上裂解组织20 min后，使用超声仪匀浆，每次连续匀浆10 s，停止操作10 s，低温操作重复5次。4 ℃离心10 min，转速12 000 r·min-1，离心半径为6 cm，离心后取上清液，将蛋白定量至质量浓度为4 μg·μL-1。每组上样10 μL进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室温封闭1 h后，加入稀释后的一抗CX43（1∶8000）和GAPDH（1∶20 000），4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）洗膜后进行化学发光显影，拍照并保存蛋白条带。Image J v1.8.0 软件分析蛋白条带的灰度值，以GAPDH 为内参照蛋白，按公式（3）计算CX43蛋白相对表达量。

2.9 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料用（）表示，符合正态分布的变量用单因素方差分析，方差齐时组间比较采用最小显著性差异法（LSD），方差不齐时，组间比较采用新复极差法检验（Dunnett′s T3），非正态则采用非参数秩和检验；计数资料用率（%）表示，用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 稳心颗粒对各组大鼠心律失常发生率的影响

心肌梗死模型制备2 周后，模型组大鼠腹腔注射ISO后结果见图1，假手术组大鼠心律失常率为0，模型组为87.5%，稳心颗粒低剂量组为75%，稳心颗粒高剂量组、美托洛尔组均为25%，5组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；组间两两比较可见，与假手术组相比，模型组大鼠心律失常发生率明显上升（P＜0.01），最易诱发心律失常事件；与模型组相比，稳心颗粒高剂量组、美托洛尔组大鼠心律失常发生率明显下降（P＜0.05），结果见表2。

表2 注射ISO后各组大鼠心律失常发生率比较（n=8）

图1 注射ISO后模型组大鼠心律失常诱发情况

3.2 稳心颗粒对各组大鼠血流动力学指标的影响

制备心肌梗死模型2 周后，模型组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均显著减少（P＜0.01），LVEDP显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，稳心颗粒低剂量组指标差异无统计学意义；与模型组相比，稳心颗粒高剂量组及美托洛尔组LVSP 增加（P＜0.05），+dp/dtmax和-dp/dtmax的绝对值显著增加（P＜0.01），LVEDP差异无统计学意义，结果见表3。

表3 各组大鼠血流动力学指标的比较（,n=8）

表3 各组大鼠血流动力学指标的比较（,n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；表5同。

3.3 稳心颗粒对各组大鼠心脏组织病理学的影响

假手术组大鼠可见心肌纤维排列致密整齐，胞核清晰，大小形态正常，细胞浆均匀红染，细胞结构完整；模型组大鼠可见梗死边缘区心肌纤维断裂，心肌间隙增宽，细胞核固缩，细胞质染色深浅不一，细胞结构混乱，大量炎性细胞浸润，梗死边缘区肉芽组织纤维化，向瘢痕组织转变；各给药组大鼠可见心肌纤维紊乱排列逐渐改善，炎性细胞少见，少量肉芽组织纤维化，结果见图2。

图2 各组大鼠心脏组织病理学变化（HE染色）

3.4 稳心颗粒对各组大鼠心肌胶原容积的影响

假手术组大鼠心肌间隙少量胶原，与假手术组相比，模型组大鼠心肌间隙内大量胶原沉积，心肌纤维化明显，心肌胶原容积分数明显增高（P＜0.01），与模型组相比，各给药组大鼠胶原纤维沉积明显降低（P＜0.01），结果见图3、表4。

表4 各组大鼠心肌胶原容积比较（,n=8）

表4 各组大鼠心肌胶原容积比较（,n=8）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

图3 各组大鼠胶原容积变化（Masson染色，40×）

3.5 稳心颗粒对各组大鼠CX43 和内质网应激相关基因表达的影响

心肌梗死2 周后，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织CX43 mRNA 相对表达量明显减少（P＜0.01），IRE1 mRNA 相对表达量增加（P＜0.05），GRP78、ATF6、XBP1 mRNA 相对表达量明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；给药治疗后，与模型组相比，稳心颗粒低剂量组XBP1、GRP78 mRNA 相对表达量显著下调（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，稳心颗粒高剂量组CX43 mRNA 表达量上调（P＜0.05），IRE1、ATF6、GRP78、XBP1 mRNA 表达量显著减少（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，美托洛尔组CX43 mRNA表达量上调（P＜0.05），IRE1、GRP78、XBP1 mRNA 表达量显著减少（P＜0.05，P＜0.01），结果见表5。

表5 各组大鼠心肌组织CX43和内质网应激相关基因表达比较（,n=8）

表5 各组大鼠心肌组织CX43和内质网应激相关基因表达比较（,n=8）

3.6 稳心颗粒对各组大鼠CX43蛋白表达的影响

心肌梗死2 周后，CX43 蛋白条带表达灰度见图4。与假手术组相比，模型组大鼠CX43 蛋白表达量明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，稳心颗粒剂量组CX43 蛋白表达量升高（P＜0.05），美托洛尔组CX43蛋白表达量明显升高（P＜0.01），结果见表6。

表6 各组大鼠CX43蛋白表达比较（,n=6）

表6 各组大鼠CX43蛋白表达比较（,n=6）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图4 各组大鼠CX43蛋白表达

4 讨论

稳心颗粒遵循古方炙甘草汤的立意组方，党参为君，补中气、养津血，改善冠状动脉供血，增加心排血量；黄精为臣，滋心阴、养心血，具有强心、调脂、增加冠状动脉血流的作用；三七化瘀活血定痛，并助黄精补养心血，增加冠脉血流，降低心肌耗氧量，调节心肌缺血缺氧状态；琥珀活血化瘀、定悸安神，可抑制心脏异常起搏点消除折返；甘松芳香行气、调畅气血，抗心肌缺血、提高心肌耐缺氧能力，诸药配伍，共奏益气养阴、活血化瘀、定悸复脉的功效[19]。临床研究表明稳心颗粒对于多种病因引起的心律失常有明显的疗效，可以快速缓解症状，改善患者的生活质量[20]。稳心颗粒的药理机制值得深入研究。

心肌梗死后，心脏结构和功能受损，心脏血流动力学指标会发生改变，这与李影雄等[21]的研究一致，本研究结果显示，心肌梗死大鼠心脏血流动力学明显障碍，心肌组织病理缺血损伤明显，心肌组织纤维化程度加重，心肌顺应性降低，这些变化为心肌梗死后心律失常的发生提供了必要条件。因此，本研究中模型组大鼠的心律失常诱发率明显增加。而稳心颗粒治疗后，大鼠心脏血流动力学和组织病理损伤得到改善，心律失常诱发率降低。为探讨稳心颗粒上述心脏保护作用的药理机制，本研究进一步从基因水平观察了缝隙连接蛋白和内质网应激通路基因表达的变化。

研究结果显示，心肌梗死模型大鼠心肌组织CX43 基因及蛋白表达明显下调（P＜0.01）。在心脏中，缝隙连接介导了心肌细胞间的电耦联，形成细胞间通路，使同步收缩的电刺激波有序传导，是维持正常心律的基础[22]。缝隙连接蛋白以六聚体形式组成半通道，相邻心肌细胞的2 个半通道对接形成缝隙连接通道[23]。其中CX43 发挥重要作用[24]，CX43的异常会导致心脏电传导障碍，最终导致心律失常的发生[3]。本研究中稳心颗粒高剂量可明显提高CX43 mRNA 及蛋白的表达水平，说明稳心颗粒具有一定缝隙连接保护作用，这是其能够降低心律失常发生率的重要机制之一。

CX43生命周期短暂、周转率高，其合成与降解的动态平衡需要严格控制[25]。生理状态下，心肌缝隙连接蛋白的代谢过程有赖于内质网的生理功能，连接蛋白在粗面内质网膜上合成[26]，由内质网腔内多种伴侣蛋白辅助折叠，并经过翻译后修饰，寡聚成六聚体组装子[27]；而如果新合成的连接蛋白不能正确折叠和寡聚化，内质网转运蛋白则会识别错误折叠蛋白，进而启动内质网相关的蛋白质降解机制，进行蛋白质质量控制[28]。因此，内质网功能紊乱可能是导致CX43 异常的关键因素之一。本研究结果显示，心肌梗死模型大鼠内质网应激通路GRP78、IRE1、ATF6、XBP1 mRNA 表达显著上调，说明心肌梗死后心肌组织缺血缺氧，内质网理化环境发生改变，其对蛋白的处理能力受损，诱发了内质网应激[29]。最初内质网应激是对抗损伤的代偿机制，通过启动未折叠蛋白反应，抑制蛋白质合成，加强未折叠蛋白折叠及降解，减轻内质网负荷[28]。若存在持续而强烈的内质网应激，则导致未折叠蛋白反应不能完全代偿损伤，蛋白合成及降解障碍，诱导细胞凋亡[30]，又成为了加重组织损伤的病理因素。本研究表明，模型大鼠心梗2 周后内质网处于过度应激状态，这是心脏CX43 受损的不容忽视的机制之一[31]。而稳心颗粒可以不同程度地下调内质网应激通路基因的表达水平，说明其减轻了心肌梗死后内质网的过度应激，是其发挥心脏保护作用的重要机制。

综上所述，本研究结果表明，心肌梗死病理状态下，内质网过度应激，CX43基因表达下调，是心肌梗死大鼠心脏血流动力学障碍和心律失常易感性增加重要影响因素，而稳心颗粒可调节CX43 和内质网应激通路基因表达，是其保护心脏减少心律失常发生的分子机制。