一株高活性纤维二糖酶真菌的筛选与鉴定

尹守亮，杨镒婴，徐黛云，刘瑶，储鑫越，李秋园，周志江

(1. 天津大学 化工学院，天津 300072；2. 华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210；3. 中溶科技股份有限公司博士后创新实践基地，河北 唐山 064000)

纤维二糖酶(cellobiase)又称β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，3.2.1.21)，能够催化多种葡萄糖苷衍生物非还原末端的β-D-葡萄糖苷残基水解，它普遍存在于细菌、真菌、植物和动物中，在各种生物的细胞内或细胞外产生和发挥功能[1]。当前，纤维二糖酶在化妆品、纺织、洗涤剂、动物饲料、烟草和食品工业、有机化学合成、天然聚合物修饰、医学诊断以及废纸脱墨等方面有着广泛的工业应用价值[2]。

纤维素是由D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的可生物降解、可再生的结构复杂多样的聚合物[3, 4]。纤维素是自然界中最丰富的多糖，也是农业废弃物中比例最高的组成部分。全世界范围内科学家普遍共识：纤维素是最宝贵的可再生能源和原材料，通过生物酶降解其为单糖葡萄糖，能将纤维素废弃物有效地转换为高附加值产品，如燃料乙醇等，这对开发可持续生物燃料等资源具有重要的意义[5]。当前，国内外多家高校、科研院所和企业公司一直致力于纤维二糖酶的研究，期望能够更好地改善纤维素酶的催化效率，有效且充分地利用廉价的纤维素资源。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种著名的产纤维素酶真菌，最早被作为研究纤维素降解机制的模式菌，其合成的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶(endo-1,4-D-glueanase，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-D-glucanase，EC3.2.1.91)和纤维二糖酶。纤维素的完全降解需要这3种酶的共同参与，其中纤维二糖酶是纤维素分解酶系中的一个重要组分，它负责木质纤维素水解的最后一步，将纤维二糖转化为葡萄糖[6]。里氏木霉自身合成纤维二糖酶的产量较低，外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶含量>92%，因此，纤维二糖酶是纤维素降解过程中的限速酶，极大程度上限制了纤维素酶实际在工业化上的应用[7, 8]。

从唐山市曹妃甸湿地腐败草丛里采集土壤样品，利用纤维二糖作为唯一碳源筛选到一株编号CB21的桔青霉真菌，其粗酶液中纤维二糖酶活性最高是里氏木霉纤维二糖酶活力的11.3倍，该研究筛选的高活性纤维二糖酶产生菌CB21为提高农业纤维素废弃物的利用效率提供了备选研究菌种。

1材料与方法

1.1 菌株与试剂

大肠杆菌克隆宿主DH5α为本实验室保存。EZ-Blunt pTOPO平末端克隆试剂盒和SuperStar Max超保真DNA聚合酶购于北京康润诚业生物科技有限公司，纤维二糖(Solarbio，G8580)、水杨苷(Solarbio，S9720)、LB肉汤培养基(Solarbio，L8291)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Solarbio，P8931)、真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，D2300)等均购于北京索莱宝科技有限公司。质粒小量提取试剂盒(OMEGA，D6943-01*)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-01)、3,5-二硝基水杨酸(上海国药试剂集团)和乳酸酚棉蓝染色液(青岛海博生物技术有限公司)均购于代理商北京江晨文轩生物科技有限责任公司。

1.2 主要仪器

快速梯度PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司，A300)，可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，V-5000)，倒置荧光显微镜(Olympus，IX73-DP80)。

1.3 培养基

纤维二糖唯一碳源培养基[9]: KH2PO415 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO40.6 g/L, CaCl20.8 g/L, MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，FeSO4·7H2O 0.000 5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L，CoCl20.000 2 g/L, 纤维二糖 10 g/L, 琼脂粉20 g/L，pH 4.8。种子培养基和发酵产酶培养基参照孟庆山文献方法[9]。

1.4 实验方法

1.4.1 利用纤维二糖作为唯一碳源筛选纤维二糖酶活性菌

从华北理工大学(曹妃甸校区)校园里腐败的草丛里采集土壤样品，用无菌水浸泡后梯度稀释涂布到含有纤维二糖为唯一碳源的筛选培养基中，30 ℃静置培养7 d，挑选长出的单菌落并在筛选培养基中传代和复筛，将复筛能在纤维二糖碳源培养基中生长良好的菌株，传代划线至PDA复合培养基中进行富集和收集孢子。将0.1 ml孢子悬液(1.0×106个/ml)分别接种到种子培养基中(250 ml三角瓶中加入 50 ml培养基)，30 ℃，180 r/min振荡培养2 d，按5%接种量转接入发酵培养基中，每隔2 d取发酵液8 000 r/min离心，测试上清液中纤维二糖酶活性。

1.4.2 纤维二糖酶活性测定方法

(1)标准液及DNS试剂

1.0 mg/ml葡萄糖标准溶液：称取1.0 g葡萄糖用蒸馏水溶解定容1 000 ml。纤维二糖酶活性测定方法采用DNS法[10]，选择水杨苷作为测定纤维二糖酶活的底物，1%水杨苷溶液：称取1.0 g水杨苷分别溶于100 ml的缓冲液中。DNS试剂配制方法如下：

A液：称取10 g 3,5-二硝基水杨酸和10 g NaOH混合后加水溶解；

B液：称取200 g 酒石酸钾钠溶解于250 ml水中，然后加入2.0 g苯酚，5.0 g Na2SO3，溶解冷却。A液和B液混合并加蒸馏水定容1 000 ml，存放棕色瓶中7 d后使用。

(2)葡萄糖标准曲线制作

取8支试管分别加入1.0 mg/ml葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 ml，每支试管用蒸馏水分别补足总体积1.5 ml，向每支试管中加入2.0 ml DNS溶液，煮沸10 min，冷却后加蒸馏水定容至10 ml，测量OD 540 nm吸光值，以葡萄糖的实际质量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(3)纤维二糖酶活性的测定(cellobiase activity)

参考张玉千、彭利沙等报道方法[11, 12]，向试管中加入1.0 ml 1%的水杨苷溶液和0.5 ml稀释后的酶液，水浴充分反应30 min，加入2.0 ml DNS试剂，加6.5 ml蒸馏水定容至10 ml，OD540 nm测定吸光度值。酶活力单位(U)定义：在50 ℃、pH 6.0条件下，1 min内催化水杨苷生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.4.3 纤维二糖酶活性菌株形态特征观察

通过血细胞计数板制备1.0×106个/ml的孢子悬液，取2 μl孢子悬液接种到PDA培养平板中，30 ℃条件下静置培养7 d，观察菌株的生长特征。用无菌牙签在平板上挑取少量的菌丝体放到载玻片上，滴加1滴乳酸酚棉蓝染色液，盖上盖玻片，进行染色固定，利用生物显微镜(目镜10×，物镜20×)观察菌丝体的微观形态特征。

1.4.4 18S rDNA基因的扩增

利用真菌基因组提取试剂盒提取菌株CB21基因组DNA作为PCR模板，使用引物NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’扩增其18S rDNA序列。PCR反应条件：98 ℃ 预变性30 s；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后与pTOPO-Blunt Vector载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆菌株送交北京擎科生物技术有限公司测序。

1.4.5 系统发育进化树分析

将测序得到的18S rDNA核酸序列提交NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)在线比对，根据比对的结果从数据库中挑选参考序列，利用MEGA 11软件构建系统发育进化树[13]。

2结果与讨论

2.1 筛选纤维二糖酶活性菌株

以纤维二糖作为筛选培养基中的唯一碳源，经过平板初筛获得63株能够在含有纤维二糖的培养基中生长良好的真菌，将这些菌株转接传代复筛，并接种到PDA培养平板上进行富集，收集孢子分别接种子瓶和发酵瓶，分离上清液测定纤维二糖酶活性。

2.2 酶学活性分析

目前文献已报道检测纤维二糖酶(β-葡萄糖苷酶)活性方法有多种，主要包括分光光度法[11]、荧光法[14]、电化学法[15]等，荧光法和电化学法虽然灵敏度较高，但实际操作过程复杂，主要用于低含量β-葡萄糖苷酶活性的检测。

图1 菌株CB21和里氏木霉RUT-C30 发酵液中β-葡萄糖苷酶活力比较

国内外纤维二糖酶活性的检测常采用分光光度法(pNPG法和水杨苷-DNS法)，主要以对硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG)和水杨苷为酶解的底物。该研究首先对分离筛选得到的菌株进行摇瓶发酵，采用水杨苷-DNS法测定和评价发酵上清粗酶液中纤维二糖酶活性。经过多轮复筛和测活，发现编号CB21的菌株粗酶液中纤维二糖酶活性较高，其酶活力最高达到342.5 U/ml，在相同的培养发酵和检测条件下，菌株CB21纤维二糖酶活力是工业菌株里氏木霉RUT-C30的11.3倍，结果如图1所示。

将菌株CB21发酵培养6 d，将发酵上清粗酶液和水杨苷底物混合，分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃保温反应30 min，如图2(a)所示，在50 ℃～80 ℃宽温度范围内该菌株纤维二糖酶仍表现出较高的酶活力(80%以上)，其中60 ℃时该酶的催化活力最高。在不同的pH缓冲液(pH 3～10)中进一步测定该菌株纤维二糖酶的活力，结果如图2(b)所示，在pH 6～9范围内上清液中纤维二糖酶活力能够保持在60%以上，其中中性pH 7条件为该酶的最适反应pH。该菌株纤维二糖酶在耐高温和宽温度范围下以及中性pH的反应环境中保持良好的活性，这拓展了其在工业上的应用价值。

图2 菌株CB21纤维二糖酶催化反应最适环境

2.3 高纤维二糖酶活性菌株的形态学特征

如图3(a)所示，在30 ℃条件下静置培养7 d，CB21的菌落直径生长的尺寸约21±2 mm，整个菌落表现较厚且致密，菌体四周边缘较为平坦，由中心向外呈现放射褶皱状，菌体中心部分有明显的凸起和凹陷，生长早期平板菌丝体呈白色，成熟后菌体正面呈现艾绿色或灰绿色，表面覆盖浓密不均的绒状白色细小菌丝，成熟的孢子饱满且呈现绿色，不易脱落。如图3(b)所示，培养平板背面菌体呈现均匀橘黄色。

图3 菌株CB21菌落正面和反面的宏观形态特征

用无菌牙签从PDA培养平板上挑取少量CB21菌丝体于载玻片上，为了便于观察，培养时间不宜过长，培养时间过长孢子容易脱落，3～5 d为宜，滴加乳酸酚棉蓝染色液固定。菌丝体的镜检显微特征如图4所示，CB21菌株的菌丝细长，在菌丝的顶端一般产生2～3个分支，分枝顶端衍生小梗，小梗上串生清晰可见的分生孢子，这些特征符合青霉真菌的特征。

图4 菌株CB21菌丝体的显微特征

2.4 系统发育进化分析

通过PCR扩增菌株CB21的18S rDNA基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察，结果如图5显示，获得大小约1 800 bp的预期DNA条带。经琼脂糖凝胶回收纯化后与pTOPO-Blunt Vector连接并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落送交第三方公司进行测序，最后将CB21的18S rDNA基因序列提交NCBI的Genbank数据库，获得该序列Genbank accession No.OM302164。

图5 18S rDNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

菌株CB21的18S rDNA序列长度为1 770 bp，上传NCBI数据库并进行在线BLAST核酸序列比对，根据比对结果从数据库中选择已公开发表的参考序列，利用MEGA软件(version 11)进行多重对位排列(Multiple alignments)，参考软件包中程序分析和构建系统发育进化树状关系图，采用NJ邻位相连法(Neighbor-joining，NJ)做进化距离分析，采用自展法(Bootstrap，重复次数1 000次)检验系统发育树的每个分支的统计学显著性分析，经过分析比较，CB21与Penicillium citrinum TG2(Genbank No. KC960012)亲缘关系最近(如图6所示)，同时结合上述该菌株宏观和微观的形态学特征，初步鉴定CB21为桔青霉种属。

纤维素降解酶系中的外切葡聚糖和内切葡聚糖催化水解纤维素成纤维糊精和纤维二糖等复杂混合物，其中纤维二糖是纤维素水解反应过程的一种反馈抑制剂，减慢纤维素的完全水解，而纤维二糖酶能够将其转化为葡萄糖，从而提高纤维素向葡萄糖的总转化率[16]。纤维二糖酶广泛存在于不同种属的微生物中，真菌作为纤维素降解酶的主要生产者，在生物技术应用方面受到了广泛的关注，文献报道产纤维二糖酶活性较高的真菌中包括子囊菌和担子菌等，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黄孢原毛皮革菌(Phanerochaete chrysosporium)及里氏木霉(Trichoderma reesei)等[17]。黑曲霉一般作为最有效的纤维二糖酶的生产者和来源，具有产量高和活性高等优点，但仍然无法满足工业生产的需求[18]。目前，关于产生高活性纤维二糖酶的桔青霉菌的报道较少[19]，该研究筛选的纤维二糖酶活性菌株为研究纤维素的充分降解提供了备选菌种资源。

图6 菌株CB21与近缘属种以18S rDNA 序列为基础构建的系统发育树状关系图

3结论

(1)将纤维二糖作为筛选的唯一碳源，经初筛、复筛获得一株高纤维二糖酶活性的真菌，编号为CB21，通过形态学鉴别和基于18S rDNA的系统发育进化分析，鉴定菌株CB21为桔青霉属真菌。

(2)在未做培养条件优化的前提下，发现桔青霉菌CB21产生纤维二糖酶的活力是纤维素酶模式菌株里氏木霉RUT-C30的11.3倍，该菌株可作为开发微生物降解纤维素技术，提高利用纤维素资源效率的备选研究菌株。

(3)桔青霉CB21发酵液中纤维二糖酶在高温环境范围内(50～80 ℃)能够保持良好的活力，且催化反应的最适pH为中性，增加了其在未来工业上的应用价值。