盐穗木转录因子HcSCL13基因的时空表达和胁迫响应特性

地力努尔·艾力木江，冯肖莉，王 艳

(新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】作为固着生物，植物主要通过调控特定基因表达以调节生长发育和应对复杂环境，其中，转录因子在植物的生长发育、防御反应、生物和非生物胁迫抗性中发挥重要作用[1-3]。【前人研究进展】GRAS是植物特有的转录调节因子家族，包含DELLA、AtPAT1、HAM、LISCL、AtLAS、AtSHR、AtSCR、AtSCL3、DLT和AtSCL4/7[4]等10个亚家族，主要参与植物叶腋分生组织的发育[5]、赤霉素信号转导[6]、雄配子的发育[7]、光敏色素信号转导[8]、根和茎的辐射状生长[9]、植物根瘤和丛枝菌根的形成[10]和逆境胁迫应答[11]等过程。Li等[12]研究发现水稻GRAS家族成员与植物生长发育有密切相关。Lee等[13]从拟南芥基因组中鉴定了33个GRAS家族成员，不同的成员表现出一定的组织特异性。近年来，越来越多的研究发现GRAS家族成员参与了植物对逆境胁迫的响应，为植物育种提供了新思路。独行菜的LaSCL18[14]和佛手的GRAS基因[15]均受低温显著诱导。柽柳GRAS基因启动子具有一些与逆境相关的顺式作用元件，该基因在植物逆境响应中发挥作用[16]。过表达水稻GRAS基因OsGRAS23显著提高了转基因水稻对干旱胁迫的抗性[17]。同样，分别来自胡杨和盐穗木的GRAS基因PeSCL7[18]和HcSCL13[19]都显著增强了转基因拟南芥对干旱和盐的抗性。尽管GRAS家族成员参与植物生长发育和逆境响应的报道日益增多，但其如何在启动子水平受到转录调节还知之甚少。【本研究切入点】盐穗木(Halostachyscaspica)属藜科(Chenopodiaceae)盐穗木属(HalostachysC.A.Mey)，是具有重要生态价值的盐生植物[20-21]，常常作为盐生植物群落的建群种[22]。HcSCL13是盐穗木中发现的第一个GRAS转录因子家族成员，隶属于PAT1分支[23]。该基因的异源表达显著增强了转基因拟南芥的生长和盐胁迫抗性[19]。【拟解决的关键问题】基于已克隆获得的启动子及启动子与报告基因GUS偶联的转基因拟南芥纯系植株[24]，在启动子水平分析HcSCL13基因在植物不同生长发育阶段及非生物胁迫下的表达特性，并通过截短删除明确影响启动子活性和盐响应的关键区域，为阐明HcSCL13基因参与生物学功能的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Col生态型 、T2代转HcSCL13启动子纯系拟南芥、野生型本氏烟草(Nicotianabenthamiana) 、农杆菌(Agrobacteriumtumfacines)GV3101、植物表达载体pBI121均为实验室保存。

植物蛋白提取试剂盒、X-Gluc、BCA蛋白定量试剂盒、乙酰丁香酮均购自索莱宝公司；MES、4-MU及4-MUG购自上海生工生物公司；PCR常用酶、限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ购自Takara公司；In-Fusion HD Cloning Kit 购自Clontech公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；实验所用引物及测序工作均在上海生工生物工程有限公司完成，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1HcSCL13启动子在拟南芥不同发育阶段的GUS组织化学染色

拟南芥种子装于1.5 mL EP管中，依次加入100 μL的次氯酸钠和900 μL的无水乙醇，上下颠倒，使种子与消毒液充分接触，弃液加入1 mL无水乙醇，上下混匀，清洗5次，过夜晾干封口备用。分别对MS培养基上生长1、3、5、10、12和15 d的种苗及营养土中生长55 d的拟南芥进行GUS组织化学染色。

1.2.2HcSCL13启动子对光的响应

表面消毒灭菌的拟南芥种子播种至MS培养基，4℃春化2 d后分别置于净光照、净黑暗和16 h光照/8 h条件下生长，分别在1、3、5、7和10 d(另加一组净光照5 d后进行黑暗处理2 d)采集样本，进行GUS组织化学染色。

1.2.3HcSCL13启动子对不同非生物胁迫响应

表面消毒灭菌的拟南芥种子播种至MS培养基，4℃春化2 d后在22±1(℃)、16 h光照/8 h黑暗条件下培养12～14 d，分别进行以下不同胁迫的处理：300 mM NaCl处理6 h、24 h、3 d、4 d；低温和10% PEG6000处理3 h、6 h、24 h、3 d；上述处理采样后分别进行GUS组织化学染色和酶活性测定。此外，一部分苗移至营养土、珍珠岩和蛭石(3∶1∶1)的基质中继续培养55～60 d，选取大小一致的叶片进行机械刮伤及GUS组织化学染色。均设置3次生物学重复。

1.2.4HcSCL13截短启动子的烟草瞬时转化及盐胁迫处理

本氏烟草种植于营养土、蛭石、珍珠岩(1∶1∶1)的基质中，置于25℃，16 h光照/8 h黑暗培养。将含有目的片段质粒的农杆菌储备液接种YEB液体培养基上(50 mg/L Kana，50 mg/L Rif)，28℃ 220 r/min震荡培养至OD595达到0.8～1.2，转至离心管后4 000 r/min离心5 min弃上清，加入1 mL渗透缓冲液进行重悬(重悬液配方：10 mM MES pH 5.6，10 mM MgCI2，100 mM乙酰丁香酮)，彻底重悬之后，用渗透缓冲液稀释至菌液OD595值约0.5～0.6，待烟草长至6～8片真叶时将含有不同长度HcSCL13启动子片段用去针头的注射器注射烟草叶片，一部分置于黑暗放置2～3 d后对叶片进行GUS组织化学染色和GUS酶活性分析；另一部分次日用300 mM NaCl灌根和喷施叶片，处理24 h后检测GUS酶活，共设3组生物学重复。

1.2.5 不同长度HcSCL13启动子偶联GUS报告基因的植物表达载体构建

根据HcSCL13启动子[24]中含有的逆境相关、厌氧、真菌刺激等顺式作用元件，对2 230 bp全长启动子进行了不同长度的截短设计。以全长启动子PHcSCL13-SP为模板，扩增不同长度的启动子片段，分别为1 730 bp (PHcSCL13-SP1)、1 450 bp (PHcSCL13-SP2)、1 124 bp (PHcSCL13-SP3)、720 bp (PHcSCL13-SP4)和239 bp (PHcSCL13-SP5)。利用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ对植物表达载体pBI121双酶切，胶回收后，用In-Fusion酶将含有相同酶切位点的PCR产物和酶切载体进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α，采用测序和酶切鉴定不同长度的HcSCL13启动子是否已置换35S启动子，将成功构建的5个融合GUS基因的表达载体分别命名为PHcSCL13-SP1-GUS、PHcSCL13-SP2-GUS、PHcSCL13-SP3-GUS、PHcSCL13-SP4-GUS和PHcSCL13-SP5-GUS。图1

1.3.6 GUS组织化学染色和GUS酶活检测

参考Jefferson等[25]方法略加修改，将植物材料完全浸没GUS染色液中(200 mM X-Gluc，10 mM EDTA，1% Trionx-100, 0.2 mM Na2HPO4，0.2 mM NaH2PO4，10 mM 铁氰化钾，10 mM 亚铁氰化钾)，置于37℃ 100 r/min摇床中染色10 h后，将植物材料移至无水乙醇中脱色，直至将叶绿素洗脱干净为止，用体视显微镜拍照观察结果。以处理的植物为材料提取总蛋白，按BCA的方法制作蛋白质标准曲线计算各蛋白浓度；以MUG为反应底物，37℃分别反应0、15、30、45和60 min，在激发波长365 nm、发射波长455 nm下检测反应产物MU含量，以每分钟单位MUG产生MU的量表示GUS酶活。

图1 HcSCL13 截短启动子植物表达载体构建示意Fig.1 Schematic diagram of PHcSCL13GUS promoter fragment vector construction with different length

表1 HcSCL13 截短启动子的引物设计Table 1 Primer design of HcSCL13 truncated promoter

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0和Graphpad Prism 5.0 分析软件进行多重比较及差异显著性分析，P<0.05代表差异显著，图表中所有数据均表示为Mean±SD。

2 结果与分析

2.1 HcSCL13启动子在转基因拟南芥不同发育阶段及部位的活性

研究表明，种苗阶段，1 d龄转基因拟南芥胚根中就检测到GUS基因的表达，3和5 d龄转基因拟南芥幼苗子叶和胚根中GUS染色较强。10、12和15 d龄种苗的地上部分与根均具有较强的GUS染色(图2A)。当植物进入成苗营养阶段时，55 d龄的转基因拟南芥地上和地下部位仍有GUS基因的表达，其中地上部位GUS染色较强(图2B)。当植物进入生殖阶段时，尽管在植株根、茎、子叶、真叶、花和角果中均有GUS基因的表达，但表达水平不同，茎、真叶、花和角果中的表达水平相对较弱、而根和子叶中的表达较强(图2C)。图2

注：A：种苗阶段，B：成苗阶段，C：生殖阶段的不同组织部位

2.2 HcSCL13 启动子在逆境胁迫下的活性

2.2.1HcSCL13启动子对光的响应

研究表明，在净光照处理下，不同萌发天数的拟南芥下胚轴无GUS酶活，而净黑暗(除萌发1 d)及光照16 h光照/8 h黑暗光周期处理下，下胚轴出现一定的GUS酶活；同时，净光照处理5 d后移至黑暗培养2 d，本无GUS 活性的下胚轴出现一定的GUS活性。当转基因拟南芥受到16 h光照/8 h黑暗处理时，HcSCL13启动子在子叶中的GUS活性最强，其次是净黑暗条件下，最弱的是净光照处理。然而，净光照处理下的种苗胚根根尖有较强的GUS基因表达，净黑暗下胚根的根冠部GUS基因表达明显强于分生区、伸长区和成熟区，而16 h光照/8 h黑暗光周期条件下整个根部的GUS基因表达较为均匀，萌发第10 d时根部的GUS基因表达明显增强。图3

注：A：下胚轴，B：子叶，C：根

2.2.2HcSCL13启动子对机械损伤的响应

研究表明，GUS的组织化学染色显著强于未损伤部位，提示该启动子积极响应机械损伤。图4

2.2.3HcSCL13启动子对低温和干旱胁迫响应

研究表明，GUS染色(图5A和5C)和酶活性检测(图5B和5D)与对照组相比没有显著性差异，该基因不受低温和干旱胁迫的诱导。图5

图4 HcSCL13 启动子对机械损伤的响应Fig. 4 Response to mechanical damage for HcSCL13 gene promoter

注：A 低温胁迫下的GUS组织化学染色；B干旱胁迫下的GUS组织化学染色；C 低温胁迫下的GUS酶活；D干旱胁迫下的GUS酶活

2.2.4HcSCL13启动子对盐胁迫的响应

研究表明，当胁迫处理6和24 h时，GUS组织化学染色(图6A)和酶活性检测(图6B)与未处理组间无显著差异；当处理3 d时，处理组GUS酶活性明显增加，而胁迫处理4 d时酶活又显著降低。以上结果提示，HcSCL13基因在启动子水平受盐胁迫的调节。图6

2.3 HcSCL13截短启动子的植物表达载体构建与鉴定

研究表明，采用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ将5个不同长度的HcSCL13启动子片段与含有报告基因GUS的pBI121质粒连接，重组质粒(pBI121-PHcSCL13SP1-SP5)的酶切不同长度启动子的植物表达载体构建成功。图7

注：A：GUS组织化学染色，B：GUS酶活；数值为3次平行实验的平均值±标准差，不同小写字母代表组间差异(P< 0.05)，不同大写字母代表组内差异(P< 0.05)

2.4 HcSCL13截短启动子活性

研究表明，HcSCL13基因不同长度启动子的活性。5个不同长度的HcSCL13启动子片段均能驱动GUS基因的表达，但GUS基因表达水平有明显差异，其中全长启动子与截短后的SP1和SP2启动子驱动的GUS染色和酶活性基本一致，SP3和SP4启动子驱动的GUS基因表达显著降低，而进一步截短后的SP5启动子驱动的GUS酶活性又显著增加至全长启动子水平。图8

注：M：5 000 bp Marker，1-5：HindⅢ和XbaⅠ分别双酶切重组质粒pBI121-PHcSCL13SP1， pBI121-PHcSCL13SP2， pBI121- PHcSCL13 SP3， pBI121-PHcSCL13SP4和pBI121-PHcSCL13SP5

注：A：GUS组织化学染色，B：酶活分析；数值为4次平行实验的平均值±标准差，不同大写字母代表组间差异(P< 0.05)

2.5 HcSCL13 截短启动子对盐响应区域

研究表明，含有全长启动子的烟草盐胁迫处理后GUS活性显著升高，转SP1、SP2、SP3和SP4启动子的烟草盐处理前后GUS酶活性无显著变化，而转SP5启动子烟草的GUS酶活性在盐处理后显著降低。启动子SP4和SP5间的区域含有盐响应的关键区域。图9

注：数值为4次平行实验的平均值±标准差，不同小写字母代表组间差异(P< 0.05)，不同大写字母代表组内差异(P< 0.05)

3 讨 论

GRAS家族成员众多，在植物不同组织和不同生长阶段的表达不尽相同，因而发挥着不同的生物学功能[26]。盐穗木GRAS转录因子HcSCL13基因可显著促进转基因拟南芥的生长和盐胁迫下的抗性[19]，且启动子序列中除具有基础调控元件外，还包含分生组织、胚乳表达相关及胁迫相关顺式作用元件[24]。有必要在启动子水平深入探究该基因发挥功能的调节机制。

GRAS家族基因启动子可调控基因在植物不同组织部位中表达。例如，Xu等[14]证明水稻OsGRAS23启动子能驱动GUS基因在根和根尖中的表达，而茎和叶中的表达相对较弱；董丽莉等[27]发现毛竹PeSCL3启动子可驱动报告基因GUS在根尖、生长点和子叶叶柄中表达，但根尖中的表达最强。Yang等[28]通过组织化学染色发现核桃JrGRAS启动子在转基因拟南芥中均有启动活性，其中也是在根和茎中的启动活力最强。研究中，HcSCL13基因启动子驱动的GUS转基因拟南芥在不同生长阶段和不同组织部位的染色结果显示，种苗和成苗阶段GUS基因均有表达，但其表达强度存在差异；其中根和子叶中GUS染色最深，而HcSCL13基因的异源表达的确可显著提高转基因拟南芥的根长和鲜重[19]，提示该转录因子在调节植物的生长发育中发挥重要作用。

HcSCL13基因启动子含有大量与光响应的I-box等响应元件[24]。研究通过GUS组织化学染色分析发现，净光照处理下，幼苗胚轴和子叶中不表达或弱表达GUS基因，但净黑暗处理后GUS基因表达增强，下胚轴和子叶中HcSCL13启动子的活性被光照抑制，而黑暗条件下激活。光照往往可以调节下胚轴的生长[29]，因而提示HcSCL13基因启动子中可能含有光响应的负调控元件，推测HcSCL13与AtSCL13基因启动子一样可能参与了光敏色素的信号转导[8]。Borello等[30]研究发现，与I-box结合的IBF-2a表达受昼夜节律调节，而盐穗木HcSCL13启动子中也含有Circadian及I-box[24]等元件。此外，16 h光照/8 h处理后转HcSCL13启动子拟南芥的下胚轴和子叶中GUS基因表达最强，表明该启动子具有光周期依赖性，与Xia等[31]的研究结果一致。

研究显示，辣椒CaGRAS基因[32]、山葡萄VaPAT[33]和葡萄VosCL14-Like[34]启动子中均含有多个与逆境相关的作用元件，且积极响应干旱和盐等胁迫。生物信息学显示，HcSCL13基因启动子中具有响应干旱、盐、低温等逆境胁迫相关顺式作用元件[25]。GUS组织化学染色和酶活性分析发现在低温和干旱诱导下GUS基因的表达无显著变化，而300 mM NaCl胁迫3 d后GUS酶活性显著增加，HcSCL13启动子能够积极响应盐胁迫，且与该基因发挥的盐胁迫抗性功能相一致[19]。含有W-box的水稻OSMT-I-4b启动子可显著提高损伤部位GUS基因的表达[35]，玉米Wip[36]启动子受机械损伤后活性也显著增强。HcSCL13基因启动子在生物信息学的预测中未发现与损伤响应相关的顺式作用元件，对转HcSCL13启动子拟南芥叶片、叶柄及花茎部位进行机械处理后，GUS基因表达显著升高，推测HcSCL13启动子中可能含有一些新的与损伤相关的顺式作用元件。

通过截短删除获得了5个不同长度的启动子片段并与GUS报告基因偶联。其中，SP1 (-1 730 bp)和SP2(-1 450 bp)含有厌氧诱导和防御反应相关的元件、SP3(-1 124 bp)含有盐响应元件、SP4(-720 bp)含有真菌引发子相关元件、SP5(-239 bp)含有盐响应和防御反应相关元件。通过GV3101农杆菌介导将全长启动子和截短启动子瞬时转化注射烟草进行GUS组织化学染色和酶活性分析，结果发现全长启动子和SP1、SP2的染色程度一致，SP3的GUS染色相对较弱、而SP4和SP5明显增强，在SP2和SP3之间含有决定启动子活性的关键顺式作用元件。Zhou等[37]发现花药发育核心调控基因DYT1启动子中的“CTCC”序列对DYT1的启动表达至关重要，而HcSCL13启动子序列分析结果显示，在SP2和SP3之间含有4个“CTCC”元件，这可能也是决定HcSCL13基因启动子活性的关键序列。通过GUS酶活性分析发现，HcSCL13全长启动子和SP1之间可能含有盐响应的顺式作用元件，而SP5中可能含有盐响应的负调控元件。Park等[38]通过截短删除发现大豆SCAM-4启动子中的“GAAAAA”(GT-1顺式作用元件)序列为病原体和盐诱导的核心顺式作用元件，能显著提高盐耐受性。HcSCL13基因启动子的生物信息学分析显示，SP5含有“GAAAAA”序列。该启动子驱动的GUS酶活却在盐胁迫下显著降低，提示该启动子区域可能还含有调节盐响应的其它关键元件。

4 结 论

4.1在稳定整合HcSCL13启动子的转基因拟南芥中，从种子萌发到种苗形成的过程中，地上和地下部位均表现出较强的启动子活性。

4.2随着植物的生长发育，启动子活性表现出一定的组织特异性。

4.3HcSCL13基因启动子对光、盐及机械损伤等胁迫积极响应。

4.4启动子上游-1 124-1 450 bp是影响其活性的区域，而上游-1 730-2 230 bp为盐响应区域。盐穗木HcSCL13启动子调节了植物的生长发育及对光、盐和损伤等非生物胁迫的响应。