薄壳山核桃叶斑病病原鉴定

吴天昊，翟敏，胡龙娇，宣继萍，巨云为，何姣

(1.南京林业大学林学院，江苏南京 210037；2.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014)

薄壳山核桃Carya illinoinensis又名美国山核桃，为胡桃科Juglandaceae山核桃属Carya植物，原产于美国和墨西哥北部[1]，是世界上重要的油料干果树之一，也是我国近十几年广泛栽培的优良经济林树种。其木材是上等的军工用材，果实醇香干脆、美味可口，作为调味食品广泛应用于餐饮行业，对人体具有很好的保健功效[2]。薄壳山核桃树形高大挺秀，能适应潮湿的土壤，拥有较为强壮的根系，具有较好的经济效益、生态效益和社会效益[3]。然而随着薄壳山核桃种植面积不断扩大，病虫害逐渐成为影响其产业发展的重要因素之一。目前薄壳山核桃病害主要有真菌、细菌和线虫病害，其中真菌病害占比最大，多以黑斑病、褐斑病、白粉病为主[4]。

赵玉梅等[5]认为薄壳山核桃黑斑病属于细菌性病害，其病原为黄单胞杆菌Xanthomonas campestris pv.Juglandis，X.campestris与伴生致病真菌链格孢菌Alternaria spp.复合侵染引起山核桃黑斑病和褐斑病。孟珂[6]认为炭疽菌Colletorichum spp.是引起薄壳山核桃黑斑病的主要菌种，在其分离得到的菌种中炭疽菌占比最大，属于优势种，并且证实了该菌对叶片和果实都具有侵染性。张传清 等[7]报道了小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora可以侵染薄壳山核桃果实从而引起黑斑病，戚钱钱[8]也认为山核桃黑斑病病原为P.microspora，主要危害果实和叶片。笔者将危害薄壳山核桃叶片的病害统称为叶斑病。

当前我国对薄壳山核桃叶斑病的研究比较滞后，不仅对病原菌的研究不够深入，而且对病原鉴定准确性也存较大疑问。笔者以江苏省南京市六合区、镇江市句容市和安徽省滁州地区的薄壳山核桃叶斑病为研究对象，旨在通过形态学和分子生物学的方法来确定薄壳山核桃叶斑病的病原菌种类，为深入探讨该病的致病机制与有效防治技术研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2020年7—8月，在南京六合区山北村西面山脚下(32°20′16″N，118°53′43″E)、镇江句容市白兔镇大蒋庄(31°57′38″N，119°18′56″E)，安徽省滁州市薄壳山核桃基地(32°34′47″N，119°8′15″E)采集感病薄壳山核桃叶片。薄壳山核桃叶斑病田间症状有2种，一种是在发病初期，山核桃叶片上出现黑色小圆点，随后逐渐分散展开，病斑逐渐扩大，呈现黑色的不规则圆斑，后期病斑扩展到整个叶片(图1A)；另一种在叶片上产生褐色小斑，后期逐渐扩散，密布在叶脉两侧，最后造成叶片枯萎卷缩直至凋落死亡(图1B)。

图1 薄壳山核桃叶斑病田间症状Fig.1 Symptoms of leaf spot of Carya illinoensis in field

1.2 病原菌的分离纯化

将田间不同感病症状的薄壳山核桃叶片分别进行组织消毒[6]，在叶斑的病健交界处用组织分离法分离病原菌，在PDA培养基上28℃恒温培养。培养3 d后，划取菌落边缘菌丝，将其转接到新的PDA培养基上进行多次纯化并保存。

1.3 病原菌形态学鉴定

菌株在PDA上活化后，制成直径5 mm的菌饼将其转接到新的PDA培养基上，于28℃培养箱黑暗培养，观察菌落形态。每隔1 d用十字交叉法测量1次菌落直径，最后分别计算菌株生长速率。待病原菌产孢后，用蔡司显微镜(Imager.M2，zeiss)观察孢子形态及其产孢结构，对病原菌进行形态鉴定[9-11]。将形态鉴定后的病原菌分别各选1株，将其编号为 JR1，JR2，LHH 和 AH3。

1.4 致病性试验

将直径5 mm的菌饼分别接种于2 a生薄壳山核桃幼苗。用高温灭菌后的针孔刺伤健康薄壳山核桃幼苗叶片，将长有菌丝的一面放置在伤口，用直径5 mm的无菌PDA琼脂块作为空白对照，每株苗只接1种菌，将接种后的幼苗放入湿度98%以上、温度25～28℃的温室内，5～7 d后观察叶片发病情况。试验进行3次重复，每个重复接种12片叶。对接种后发病的山核桃叶片，再次分离病原菌。根据柯赫氏法则，若分离的菌株与原接种菌株一致，则可确定该菌为薄壳山核桃叶斑病的病原菌。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

从菌落表面取少量菌丝，采用CTAB法提取真菌DNA。采用引物 TEF1/TEF2和 RPB2-5f2/RPB2-7cr[12]对菌株 JR1进行片段扩增；采用ITS1/ITS4[13]对JR2进行扩增；采用 ITS1/ITS4和Bt2a/Bt2b[14]对LHH进行扩增；采用ITS1/ITS4和HSP60-F/HSP60-R[15]对 AH3进行 PCR扩增。用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测并送往上海杰李生物科技有限公司测序。

将测序获得的各病原菌基因序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行BLAST比对，并在Genbank数据库中进行同源性对比分析，下载相似度较高的参考序列，并运用Phylo-Suite软件基于最大似然法(ML)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征

从田间采集的2种病叶中共分离到96株菌，经形态学观察，初步确定为9株镰孢属Fusarium真菌(代表菌株JR1)、7株暗球腔菌属Phaeosphaeria真菌(代表菌株JR2)、19株葡萄座腔菌Botryosphaeria真菌(代表菌株LHH)、12株葡萄孢属Botrytis真菌(代表菌株 AH3)，分离率依次为 9.3%，7.2%，19.8%，12.5%。

27℃下，菌株JR1在PDA上平均生长速率为1.4 cm/d，菌丝初期呈乳白色并向四周均匀扩散，3 d后菌落中间开始产生砖红色的色素(图2A)。JR1的孢子类型有2种，一种为分生孢子，另一种为厚垣孢子。分生孢子中，大孢子镰刀状，透明或半透明，3～5个隔膜，(24.86～32.94)μm×(3.63～4.16)μm；小孢子单细胞，长椭圆形，透明或半透明，(4.46～11.23)μm×(2.28～3.80)μm(图2B)。 厚垣孢子单生(图2C)。结合菌株 JR1的菌落形态，根据BOOTH分类系统的形态学鉴定方法[9]，初步鉴定为镰孢菌属Fusarium。

图2 菌株JR1培养性状和孢子形态Fig.2 Culture characteristics and spores morphology of the strain JR1

菌株JR2生长较为缓慢，平均生长速率为0.6 cm/d，菌丝初期呈白色，后逐渐变灰色，菌落呈不规则圆形，培养基背面为暗黑色(图3A)。JR2的孢子长棒状，弯曲或不弯曲，顶部钝圆(图3B)，(17.26～25.04)μm ×(3.19～3.68)μm，分生孢子梗聚生成环形垫状的分生孢子座(图3C)。结合菌株JR2的菌落形态，参照真菌鉴定手册[10]，初步鉴定为暗球腔菌属Phaeosphaeria。

图3 菌株JR2培养性状和孢子形态Fig.3 Culture characteristics and spores morphology of the strain JR2

菌株LHH平均生长速率为1.85 cm/d，菌丝初期纯白色，之后逐渐暗沉直至变成深褐色，菌丝外围菌丝呈絮状，气生菌丝发达(图4A)。LHH的子座为黑色球状(图4B)，分生孢子座环形透明，孢子长椭圆形，透明无色(图4C)，(15.92～18.87)μm ×(4.53～6.98)μm。结合菌株LHH的菌落形态，根据赵嘉平的分类方法[11]，初步鉴定为葡萄座腔菌属Botryosphaeria。

图4 菌株LHH培养性状和孢子形态Fig.4 Culture characteristics and spores morphology of the strain LHH

菌株AH3平均生长速率1.07 cm/d，菌丝初期呈淡橘红色，质地较硬，放射状同心圆生长，气生菌丝较少(图5A)，培养10 d左右出现黑色菌核，菌丝的颜色也变为灰白色(图5B)。分生孢子生于分生孢子梗分枝末端的膨大体表面，呈葡萄串状(图5C)，单孢，卵圆状或椭圆状，几乎无色或略显淡色，有内核(图 5D)，(6.72～9.86)μm ×(9.00～13.48)μm。结合菌株AH3的菌落形态，参照真菌鉴定手册[10]，初步鉴定为葡萄孢属Botrytis。

图5 菌株AH3培养性状和孢子形态Fig.5 Culture characteristics and spores morphology of the strain AH3

2.2 病原菌致病性

将病原真菌的代表菌株JR1，JR2，LHH，AH3的菌饼分别接种于2 a生薄壳山核桃叶片7 d后，接种JR1的叶片出现大面积圆形的黑色病斑，直径3.2～3.4 cm，叶片背面出现肉色的孢子堆(图6A)，发病率90.9%；接种JR2和LHH的叶片均出现黑斑，但与JR1相比黑斑面积较小，接种JR2后黑斑直径为2.4～2.7 cm(图6B)，发病率100%；接种 LHH后叶片发病但不明显，病斑直径0.3～0.5 cm(图6C)，发病率75.0%；接种AH3的叶片出现淡褐色圆斑，直径1.2～1.8 cm(图6D)，病斑处叶片发脆，发病率100%。对照组叶片未感病。将接种发病叶片再次进行病原菌分离，分离到的病原菌与野外采集病叶上分离到的一致。

图6 薄壳山核桃叶片接种病原菌7 d后发病症状Fig.6 Symptoms of leaves of Carya cathayensis after 7 days inoculated with four strains

2.3 病原菌分子生物学鉴定

菌株JR1的TEF和RPB2序列上传至NCBI后登录号分别为MZ416740和MZ416741，串联TEF和RPB2构建菌株JR1的系统发育树。JR1与参考菌株共享镰孢菌Fusarium commune B9s5、F.commune LN-15-1、F.commune LN-15-2 聚在一个分支上，节点支持率BS=89(图7)。

图7 基于TEF和RPB2串联基因构建菌株JR1的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree based on TEF and RPB2 genes of the strain JR1

菌株JR2的ITS序列登录号为MZ411430，构建其系统进化树。JR2与暗球腔菌属下的Phaeosphaeria fuckelii F22、P.fuckelii 39 CCA同源性较近，处于一个分支，节点支持率BS=97(图8)。

图8 基于ITS基因构建菌株JR2的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree based on ITS gene of the strain JR2

菌株LHH的ITS和TUB2序列登录号分别为MZ416742和MZ399200，串联两基因后构建系统进化树。LHH与茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea ZB-49、B.dothidea ZB-2、B.dothidea ZB-70同源性较近，节点支持率BS=86(图9)。

图9 基于ITS和TUB2串联基因构建菌株LHH的系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree based on ITS and TUB2 genes of the strain LHH

菌株AH3的ITS和HSP60序列登录号分别为MZ416739和MZ411430，串联两基因构建系统进化树。AH3与灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea PVUPG 238、B.cinerea PVUPG 207、B.cinerea PVUPG 212同源性较近，处于一个大分支，AH3与B.cinerea PVUPG 238又单独聚为一个小分支，节点支持率BS=94(图10)。

图10 基于ITS和HSP60串联基因构建菌株AH3的系统发育树Fig.10 Phylogenetic tree based on ITS and HSP60 genes of the strain AH3

3 结论和讨论

目前薄壳山核桃叶斑病的病原有多种，不同的病原致病性也不同。本研究中，从薄壳山核桃叶斑病的病叶共分离获得96株菌，通过形态学观察、致病性测定和分子生物学鉴定，发现4种致病真菌，分别为共享镰孢菌Fusarium commune、Phaeosphaeria fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea。

镰孢属可以引起多种植物病害。Chen等[16]在胡桃木茎溃疡病中分离到茄病镰孢菌Fusarium solani并证实了其为病原菌；尖孢镰孢Fusarium oxysporum能够使兜兰Paphiopedilum叶片萎蔫枯死、根茎腐烂，引起兜兰萎蔫病[17]，严重影响其观赏性，还能引起甜瓜枯萎病，使甜瓜主根及果实腐烂，造成严重的经济损失[18]。镰孢属真菌寄主范围较为广泛，但是国内还未见其侵染薄壳山核桃叶片的报道。

暗球腔菌属真菌Phaeosphaeria spp.是多种植物病害的病原菌，分布在世界各地，可以侵染香蕉，使其形成叶斑，干枯、发黑、减少香蕉的光合作用，严重影响果实的产量与质量[19]；还可以侵染竹叶形成竹叶枯型丛枝病，对淡竹Phyllostachys glauca、桂竹P.bambusoides危害最为严重[20]，该属的其他一些真菌亦可以引起谷类叶枯病[21]。笔者从薄壳山核桃叶片分离得到的菌株JR2为Phaeosphaeria fuckelii，发现其可以危害薄壳山核桃叶片，并且是一种致病性很强的新病原，应当引起重视。

据报道，茶藨子葡萄座腔菌B.dothidea，在山核桃枝干上具有极大的致病性，是一种常见的林木干腐病菌[22]。B.dothidea在大量健康的植物上也可以被分离得到，说明该菌可以作为多数植物的内生真菌[23]，但其对于某些特定的寄主却可以造成毁灭性的打击。国内有多数研究表明B.dothidea对山核桃、杨树、桃树等的枝干具有极大的致病性[23-24]。本研究中，B.dothidea对薄壳山核桃叶片具有一定的致病性且分离率较高，虽然其发病率与发病面积相较于其他3种病原菌略低，致病性最弱，但在防治薄壳山核桃叶斑病时，仍不容忽视。

薄壳山核桃褐色叶斑多见于叶片、果实和嫩梢，病斑外围常常伴有黄色晕圈，病叶枯死脱落，果实产量受到影响。杨莉等[25]在对四川核桃褐斑病的病原菌进行分子生物学鉴定后，确定了其病原菌为链格孢菌Alternaria alternata；核桃日规壳 Gnomonia leptostyla也可以引起核桃褐斑病[26]。本研究中，灰葡萄孢B.cinerea对薄壳山核桃叶片具有致病性，导致叶片出现褐色病斑。

薄壳山核桃叶斑病的发生还与其他多种因素有关。有研究表明，薄壳山核桃叶斑病发病率与海拔高度呈负相关[26]；酸性土壤比碱性土壤更容易引发薄壳山核桃叶斑病[27]，因此低海拔碱性土壤种植薄壳山核桃可以减少叶斑病的发生。目前关于F.commune、P.fuckelii、B.dothidea、B.cinerea 侵染薄壳山核桃引起叶斑病还未见有详细的报道，有待今后深入研究。