猪流产胎儿中猪圆环病毒3型的检测及其遗传演化分析

何 庆，李周勉，王 欢，李丹彤，谭庆辉，邹亚文，苏建明，邓治邦，杨 毅，王乃东*

(1.湖南农业大学动物医学院 兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室 兽用疫苗逆向创制湖南省工程研究中心，长沙 410128；2.长沙市望城区高塘岭街道农业农村综合服务中心，长沙 410128；3.娄底市动物疫病预防控制中心，娄底 417000)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCVs)是目前报道最小的单股负链DNA病毒，病毒粒子大小为17 nm左右，呈正20面体结构。迄今为止，PCVs分为4种(即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4)，其中PCV1无致病性；PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PWMS)等一系列猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，给世界生猪产业造成了巨大经济损失；PCV3是于2016年在美国从患有猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内鉴定出的新型猪圆环病毒，其致病性目前尚不明确；而PCV4是于2020年在中国湖南病猪体内发现的新型猪圆环病毒。

PCV3已在日本、中国、瑞典、俄罗斯、巴西、丹麦、意大利和西班牙等多个国家和地区流行，PCV3通常与PCV2、PEDV、TTSuV和PPV等其他病毒发生混合感染，并且PCV3还可以感染犬和牛等其他动物。PCV3基因组全长为2 000 bp，与PCV1和PCV2基因组序列的相似性仅为31%～48%，与PCV4的相似性为43.2%。PCV3包括3个主要开放阅读框(open reading frames，ORFs)，ORF1具有非ATG启动子(GTC)，编码由296～297 aa组成的复制酶(replication-associated protein，Rep)；ORF2编码214 aa组成的衣壳蛋白(capsid protein，Cap)，与蝙蝠圆环病毒相似性为35%，与PCV2 Cap的核苷酸和氨基酸相似性仅36%和26%，有研究表明，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性。基于PCV3唯一结构蛋白Cap的两个突变位点(A24V和R27K)，可将PCV3分为PCV3a、PCV3b和PCV3c。根据已有报道，PCV3的突变位点主要位于Cap蛋白，且集中在R10K、A24V、K77R、N56D、S77T、F104Y和I150L。多项研究认为PCV3感染主要与繁殖障碍和皮炎肾病综合征等临床症状有关。

目前，在我国已有27个省级行政区域报道了PCV3阳性病例，PCV3广泛流行对我国生猪产业造成了威胁。为分析猪流产胎儿中PCV3的感染及其遗传进化情况，本研究采用PCR检测方法对2015—2017年采集的猪流产胎儿病料进行PCV3的检测，结合序列的生物信息学分析，解析其遗传进化规律，为后续深入研究PCV3遗传变异及其相关致病性提供了重要参考信息。

1 材料与方法

1.1 临床病料及试剂

2015—2017年，从湖南省长沙市、湘潭市和娄底市等12个行政区域的30个猪场共采集了680份表现为弱胎、死胎和木乃伊胎等临床症状的流产胎儿病料(肺、淋巴结、肝、脾、肾、血清等)，提取病料中病毒基因组DNA后-80 ℃保存于实验室。2×Easy聚合酶和大肠杆菌DH5α感受态细胞，均购自北京全式金生物技术有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒、OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和小提质粒试剂盒，均购自广州飞扬生物工程有限公司。

1.2 引物设计

根据GenBank中登录的全长PCV3序列为模板(GenBank：KY363870.1)，设计1对引物检测PCV3及扩增ORF2基因序列；设计3对引物分段扩增PCV3全基因组(见表1)。参考实验室已发表文献，合成PCV2检测引物，引物均由擎科新业生物技术(长沙)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 PCV3 ORF2基因的PCR扩增

向适量的病料中加入PBS缓冲液，在无菌条件下研磨，并反复冻融3次, 6 000×离心10 min, 取上清用于病毒核酸的提取，病毒基因组提取严格按照试剂盒说明书进行。采用PCR方法检测PCV3，PCR反应体系为50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反应条件：95 ℃2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃20 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 PCV3全基因组扩增

采用3对引物(PCV3-P1、PCV3-P2和PCV3-P3，表1)分段扩增PCV3全基因组，PCR反应体系同“1.3”。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 PCV2 PCR检测

采用常规PCR方法对PCV3阳性样本，进行PCV2检测，PCR反应体系为50 μL，其中，25 μL 2×Easy聚合酶，模板DNA 5 μL，上下游引物各2 μL，ddHO 16 μL。反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.6 目的片段胶回收、克隆鉴定和测序

对PCR检测为阳性的样本，用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收阳性PCR产物，连接至pMD18-T克隆载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落继续扩增过夜，提取质粒后送长沙擎科新业生物技术有限公司测序。

1.7 PCV3全基因组和ORF2基因变异与演化分析

使用DNAStar软件对PCV3全基因组测序结果进行拼接，将其与国内外参考毒株序列进行同源性分析、比对。利用MEGA 5.0软件，使用Neighbor-joining法对获得的PCV3全基因组序列和Cap蛋白氨基酸序列分别构建系统进化树。通过ClustalW软件对PCV3 Cap蛋白氨基酸进行多重序列比对分析。

2 结 果

2.1 猪流产胎儿样品中PCV3检出情况

为了调查猪流产胎儿中PCV3感染率，选择2015—2017年湖南省12个行政区域的猪场采集保存的680份流产胎儿病料，提取病毒基因组DNA后进行PCR检测，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果显示(部分病料的检测见图1)：在680份病料中共检测出166份病料呈PCV3阳性，PCV3阳性率为24.4%(166/680)，其中，2015年为18.2%(26/143)，2016年为22.7%(54/238)，2017年为28.8%(86/299)(图2A)。在湖南省各个地区的样本中均检测出PCV3阳性(图2B)：长沙(39/166)、益阳(7/166)、娄底(24/166)、湘潭(19/166)、株洲(12/166)、永州(6/166)、常德(2/166)、邵阳(8/166)、郴州(10/166)、岳阳(27/166)、湘西(4/166)和怀化(8/166)，说明PCV3在湖南省地区猪流产胎儿中广泛存在。对PCV3阳性样本DNA进行PCV2混合感染检测发现，166份病料中共有49份呈PCV2阳性，PCV3和PCV2 混合感染率为29.5%(49/166)。

1～9.临床样品；NC.阴性对照；M.DL5000 DNA相对分子质量标准

A.2015—2017年采集病料样品的PCV3阳性率；B.PCV3阳性样品的地区分布

2.2 基因组序列相似性分析

重组阳性质粒经测序、拼接，获得1株PCV3全基因组序列，序列全长2 000 nt，将该序列命名为PCV3/CN/Hunan-57(GenBank登录号为MZ934695)。利用MEGA 5.0软件将PCV3/CN/Hunan-57序列与NCBI上报道的国内外PCV3毒株序列进行比对分析，并绘制系统进化树(图3)。发现PCV3/CN/Hunan-57与参考毒株序列相似性为97.8%～99.2%。其中，与PCV3-CN/FuJian-1215-2016(KY924474)和CN/Hubei-610/2016(KY354038)亲缘关系最近，与PCV3/CN/Fujian-12/2016毒株(KY075987)亲缘关系最远。

黑色圆点表示本研究此次获得的PCV3基因组序列

2.3 Cap的遗传演化分析

从PCV3阳性样品中扩增获得了5株PCV3 Cap序列(CHN/HN-1/2016、CHN/HN-2/2016、CHN/HN-3/2016、CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017)，与GenBank已登录的PCV3 Cap序列进行遗传进化分析，结果显示，PCV3可分为PCV3a、PCV3b和PCV3c 3个亚群(图4)，本试验获得的PCV3序列分别位于其中2个亚群上，1株属于PCV3a(24 A和27 R)，4株属于PCV3c(24 V和27 K)。CHN/HN-1/2016和CHN/HN-3/2016与这3株参考毒株[PCV3/CN/Guangdong-SG/2016(MF589117)、PCV3/CN/Hunan-CZ/2017(MF589126)和PCV3/CN/Guangxi-L2/2017(MF589119)]亲缘关系较近。此外CHN/HN-4/2017和CHN/HN-5/2017处于同一进化分支，同源关系较近。CHN/HN-2/2016与其余毒株处于不同进化分支，提示有不同类型的PCV3毒株在湖南省地区猪流产胎儿中流行。

黑色圆点表示本研究此次获得的PCV3 Cap基因序列

2.4 Cap同源性分析和多重序列比对

同源性分析结果显示，获得的5株PCV3 ORF2基因序列之间的核苷酸和氨基酸相似性分别为97.5%～98.3%和96.7%～99.7%，与国内外参考毒株ORF2基因序列相比，其核苷酸和氨基酸相似性分别为96.3%～99.2%和96.8%～100.0%。对获得的5株和GenBank报道的PCV3 Cap蛋白氨基酸序列进行多重序列比对，以评估PCV3 Cap蛋白的氨基酸突变。结果显示，PCV3a突变频率高于PCV3b和PCV3c，从流产胎儿样品获得的Cap序列中鉴定出T100A、G113S和A184S突变位点(图5)，基于截至2021年8月10日的GenBank中PCV3序列同源性分析，本研究鉴定的氨基酸突变位点在已经报道的PCV3序列中未出现。

黑色方框表示鉴定出的新氨基酸突变位点

3 讨 论

PCV3自2016年被发现以来，陆续在不同临床症状(如PDNS、母猪繁殖障碍、多系统炎症和神经症状等)或健康猪中检测出PCV3感染，其中繁殖障碍和多系统炎症是报道最多的临床症状。Deim等从猪流产胎儿和弱仔的多种器官中检测到PCV3感染；Santo等对276例木乃伊胎进行病原体检测，发现270例检测为PCV3阳性，其中,PCV3单独感染仅有12例；Saporiti等通过原位杂交(hybridization，ISH)方法在猪流产胎儿的组织学病变中发现PCV3基因组；Zou等研究发现有繁殖障碍症状的母猪中PCV3阳性率高于健康母猪，Kedkovid等发现母猪的初乳样本中PCV3阳性率为44.74%(17/38)，血清样本中阳性率为47.37%(18/38)；初产母猪的初乳样本中PCV3阳性率高达71%，高于经产母猪阳性率(33%～43%)。另一项研究发现初产母猪的PCV3感染胎儿数量显著高于经产母猪，且PCV3病毒载量较高，这些进展进一步证实了PCV3在导致母猪繁殖障碍中具有潜在的作用。

近期报道西班牙农场中猪流产胎儿或死产仔猪组织样品的qPCR检测发现，PCV3阳性率为33.9%，本研究对湖南省680份猪流产胎儿病料样品PCR检测发现，PCV3阳性率也较高(24.4%)，并且PCV3阳性率在2015—2017年，呈现逐年上升的趋势，说明PCV3在流产胎儿中一直有较高水平的流行。尽管多数报道中认为PCV3是一种可导致母猪繁殖障碍的病原体，但仍需进一步分离毒株，通过试验验证PCV3对母猪或胎儿、仔猪的具体致病性。

PCV2诱导的淋巴细胞增殖或免疫抑制可增强对其他病毒复制和感染的易感性，而PCV3与其他病原混合感染后的影响尚不完全清楚。Ha等统计分析显示，PCV3可能提高PCV2和PRRSV感染率，并与猪临床疾病有潜在关联。在作者前期的另一项PCV3和PPV7混合感染检测研究中发现，母猪PPV7 阳性血清样本中PCV3的拷贝数显著高于PPV7阴性血清样本，因此推测PPV7可能促进PCV3复制。本研究检测发现PCV3和PCV2混合感染可达29.5%(49/166)，这与前期国内外的报道基本一致。鉴于PCV3临床混合感染和母猪繁殖障碍影响的存在，需加强PCV3与猪常见繁殖障碍病原体的混合感染检测(如新一代测序NGS)，并探索PCV3混合感染与繁殖障碍等致病性的关系。

PCV3结构蛋白Cap突变可能会影响PCV3的毒力和致病性。Ha等对PCV3进化过程中Cap蛋白主要氨基酸的突变情况进行了分析，其中突变频率最高的氨基酸位点分别为A24V、K27R、S77T、F104Y和I150L。前期报道临床表现有繁殖障碍的母猪和流产胎儿样品中的 PCV3 Cap序列均存在S77T和I150L突变位点，且这些突变位点常出现在PCV3a毒株。近期有研究表明，从越南猪流产胎儿中鉴定出3个PCV3 Cap蛋白的新突变位点(K139R、I150F和P169T)。本研究发现来自猪流产胎儿的PCV3 Cap序列中出现T100A、G113S和A184S新的突变位点，且进化分析显示，阳性毒株均属于PCV3c，这表明虽然PCV3基因组稳定，但仍在不断适应进化，而Cap突变位点的改变是否影响PCV3感染和致病性需进一步验证。

4 结 论

本研究对湖南省地区于2015—2017年采集的猪流产胎儿病料样品进行PCR检测，结果表明猪流产胎儿中PCV3感染率较高，且存在不同类型的PCV3毒株感染。