靶向野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶潜在活性小分子的发现

姜德文 吴明凯 张永豪 龙治峰

摘要：目的 运用分子对接技术发现靶向野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶的潜在活性小分子。方法 选取野生型（WT）和S94A突变型（S94A）Enoyl-ACP还原酶蛋白作为受体，运用Autodock vina从Specs和Chemdiv商业数据库中筛选具有抗结核潜力的双靶向野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶活性小分子。结果 与野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶结合亲和力排名前2300的小分子共12个。结论：小分子AK-968/12686317和S035-0495是潜在的靶向野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶活性小分子。

关键词：S94A突变型;Enoyl-ACP还原酶;分子对接，结核分枝杆菌

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性疾病。2020年全世界结核病新发生987万例，发病率达0.127%，死亡率达0.017%。中国作为结核病高负担国家，结核病新发生84.2万例，高居世界第二位，发病率高达0.059%，死亡率达到0.0021%[1～2]。目前针对结核病常用的药物主要有异烟肼、链霉素、利福平等。然而，随着药物的广泛运用，耐多药结核病已经是全世界共同面临的重大公共卫生新挑战，严重阻碍了结核病的治疗和防控[3]。

随着核心一线抗结核药物利福平和异烟肼耐药的发生，开发新型抗结核药物减少耐药的发生迫在眉睫[4]。异烟肼被认为是结核病化疗的基石，探究其抗结核作用机制，特别是分子耐药机制，将有助于正确选择抗结核药物，并将促进新型靶向抗结核药物的发现和开发[5～7]。Enoyl-ACP还原酶（Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase）是异烟肼的作用靶点，当氨基酸丝氨酸（S）94突变成甘氨酸（A）后，会导致结核分枝杆菌对异烟肼的耐药[8～9]。如果设计一些同时抑制野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶的小分子，将较好地缓解Enoyl-ACP还原酶S94A突变引起的结核分枝杆菌的耐药问题。本研究采用分子对接方法，筛选同时与野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶具有较好结合亲和力的小分子，为抗结核分枝杆菌Enoyl-ACP还原酶发生S94A突变提供一定的参考依据。

1方法

（1）野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶受体准备

从PDB数据库中分别提取野生型S94A Enoyl-ACP还原酶（PDB ID：2B35）和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶（PDB ID：2NV6）蛋白-配体复合物三维结构，运用pymol软件去掉水分子，运用AutoDockTools1.5.6进行蛋白准备，加氢并以配体为核心定义20*20*20的盒子大小为活性位点。

（2）配体准备

配体小分子选取Specs和Chemdiv商业数据库的小分子，经过优化加氢处理后，再用OpenBabel进行切割，将小分子sdf格式转成pdbqt格式文件，且每个小分子以数据库的名字命名，即获取准备好的配体。

（3）分子对接

运用Autodock Vina将准备好的小分子与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶进行分子对接，通过对接打分判断小分子与蛋白的结合强弱，选取对接打分排名前2300的小分子进行分析。

2结果

2.1 小分子与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶结合情况

分别选取与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶对接打分靠前的N084-1026、G194-0411和4296-0065等2300个小分子进行叠合，发现有12个小分子是重复的（见图1），即提示这12个小分子同时与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶有较强的亲和力。它们分别为小分子N084-1026、715-0286、AE-848/11829359、4296-0065、2188-1976、AK-778/11278028、G843-0635、G194-0411、4552-4269、T425-1160、AK-968/12686317和S035-0495。

2.2 潜在活性分子与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶相互作用模式

为了进一步找到最具有潜力去抑制野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶的小分子，本研究比较了12个小分子与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶的对接打分结果，如图2所示，这些小分子与野生型Enoyl-ACP还原酶的对接打分在-7.2 kcal/mol ～ -10.0 kcal/mol之间，与突变型S94A Enoyl-ACP还原酶的对接打分在-6.8 kcal/mol ～ -9.6 kcal/mol之间。通过统计结果显示，对接打分同时优于-9.5 kcal/mol的小分子为AK-968/12686317和S035-0495。

结合以上对接打分所得到的结果，本研究考察了排名靠前的小分子AK-968/12686317和S035-0495分别与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶的相互作用模式（见图3）。在野生体系中，小分子AK-968/12686317与Enoyl-ACP还原酶的Met98形成两个氢键，与Try158形成π-π堆积作用;在S94A突变体中，虽然氢键消失，但是AK-968/12686317的疏水端与Phe149和Trp222形成强的π-π堆积作用。小分子S035-0495在野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶中，均能形成较强的氢键作用。此外，疏水性苯环插入由Phe149、Tyr158和Ile215组成的空腔中，能够增强它们之间的作用。

3 结论

结核病是一种主要以呼吸道传播途径引起的慢性疾病，因其治疗周期较长，会对患者造成极大的精神和經济负担。由于预后疗效不良、失访率较高等因素影响，导致结核病发病率在近年来呈现上升的趋势，尤其以耐药性结核病较为多见[10～11]。耐药性结核病防治困难重重，寻找靶向抗结核药物是临床亟待解决的关键问题。鉴于以上的需求，本课题以一线抗结核经典药物异烟肼对结核分枝杆菌的作用为切入点，设计同时对野生型和S94A突变型Enoyl-ACP还原酶都具有抑制作用的小分子来解决结核分枝杆菌的耐药问题。

本研究通过运用分子模拟技术在PDB蛋白质结构数据库中找到同时与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶有较强亲和力的12个活性小分子，再选用Autodock Vina进行分子对接，以考察12个活性小分子分别与野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶之间的相互作用后，显示AK-968/12686317和S035-0495

小分子是潜在的野生型和突变型S94A Enoyl-ACP还原酶抑制剂。

综上所述，为了有效遏制耐药性结核病例的发生，必须积极寻找到相关靶向药物，尤其是找到活性小分子靶向作用于耐药性结核病的突变靶点。本研究发现的AK-968/12686317和S035-0495可能是较为有效抑制耐药性结核的活性小分子。

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