人参皂苷Re对东莨菪碱致小鼠神经炎症和认知功能障碍的保护作用研究

刘昌福 邓钢 欧阳敏 吴剑华

摘要：目的 探究人参皂苷Re对东莨菪碱诱发的C57BL/6J小鼠学习记忆障碍的改善作用及其作用机制。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠经训练合格随机分为6组，即正常组、模型组、阳性组，以及人参皂苷Re低、中、高剂量组。正常组注射等体积生理盐水，其他组腹腔注射2 mg/kg东莨菪碱溶液。同时，阳性组给予10 mg/kg多奈哌齐溶液，人参皂苷Re低、中、高剂量组分别给予10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人参皂苷Re溶液，其他组灌胃等体积生理盐水。Morris水迷宫实验评价小鼠的记忆能力。取脑组织，HE染色和试剂盒方法测定脑组织中AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6水平。结果 与正常组相比，模型组小鼠上台潜伏期显著增加，TNF-α、MDA、IL-6水平显著升高，AChE、ChAT、GSH含量和海马神经细胞明显减少;相比模型组，5 mg/kg多奈哌齐和10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人参皂苷Re给药后上台潜伏期显著降低，脑内AChE、ChAT、GSH显著升高，而TNF-α、MDA、IL-6水平显著降低，改善神经细胞损伤。结论 人参皂苷Re可以通过下调大脑内的炎症反应、氧化应激及修复海马的损伤来改善C57BL/6J小鼠的学习记忆障碍。

关键词：人参皂苷Re;记忆障碍;炎症

阿尔茨海默病（AD）是老年人中常见的进行性痴呆症之一，影响患者记忆、思维、语言，对患者的生活质量产生不利影响[1]。研究发现，AD的可能病因包括胆碱能和β-淀粉样蛋白（Aβ）水平、脑血流量、神经递质波动、神经炎症和氧化应激的发展[2]。在AD中，海马和新皮质等大脑区域处理记忆、行为、学习和情绪反应，患者的胆碱能功能受损，乙酰胆碱（ACh）水平降低。乙酰胆碱酯酶（AChE）负责乙酰胆碱的水解[3]。因此，抑制乙酰胆碱酯酶是治疗AD的关键[4]。氧化应激和炎症反应在AD的发病机制中起着关键作用，其特征是自由基生成速率与身体抗氧化防御系统之间的不平衡[5]。有研究表明，人参皂苷Re作为人参中微量的有效成分，有助于预防健康问题，缓解脑缺血损伤[6]，提高大鼠大脑中抗凋亡介质的水平[7]，以及改善老年痴呆的线粒体病理[8]。

因此，本研究将依据东莨菪碱造模的常规途径，研究人参皂苷Re对C57BL/6J小鼠记忆障碍的氧化还原、炎症应激等作用，为人参皂苷Re整体入药改善学习记忆作用的科学机制提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

取适量人参皂苷Re（大连美仑生物公司，货号：MB6952）溶于生理盐水中，超声至澄清，配置成4 mg/mL人参皂苷Re溶液备用。取50片多奈哌齐片（大连美仑生物有限公司，批号：20213102E3217，规格：5 mg /片，）研磨后溶于50 mL生理盐水中，搅拌至澄清，配置成10 mg/mL溶液备用。精密称量60.07 mg东莨菪碱，加入300 mL生理盐水中，超声至澄清，即得0.2 mg/mL的东莨菪碱溶液，以上溶液均4 ℃保存。

1.2 动物分组与给药

雄性C57BL/6J小鼠，重量36～41 g（湖南斯莱克动物公司提供），所有程序均符合《动物实验规程》，合格证号：SCXK（赣）2022-0015。環境温度控制在25±2 ℃，适应性饲养7天之后开始实验。

分组实验前，对C57BL/6J雄性小鼠进行3天的Morris水迷宫（上海移数有限公司，MWM-M）游泳训练，剔除平台潜伏期大于1 min的小鼠。将合格的36只小鼠随机分为6组，每组6只，分别为正常组、模型组、阳性对照组（多奈哌齐，10 mg/kg）、人参皂苷Re低（10.02 mg/kg）、人参皂苷Re中（20.1 mg/kg）、人参皂苷Re高（40.2 mg/kg）剂量组。其中，正常组和模型组给予0.9%生理盐水，灌胃体积为0.4 ml/20 g小鼠体重。每天上午9点称重后，模型对照组与给药组均腹腔注射东莨菪碱注射液，空白组腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，共给药两周。每天下午3点，正常组灌胃等体积0.9%生理盐水，其他组灌胃给药30 min后，灌胃2 mg/kg东莨菪碱溶液。

1.3 试剂

AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6检测试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。

1.4 仪器

Morris水迷宫（上海移数有限公司，MWM -M）;MGO全波长酶标仪（赛默飞中国分公司）。

1.5 方法

1.5.1 行为学测定

在试验开始前的两天内，允许所有动物每天在没有平台的泳池中游泳60 s，以评估它们的运动活动和对周围环境条件的适应能力。随后5 d，放置平台后小鼠被允许在迷宫中探索60 s，如果小鼠无法自己找到平台，小鼠会被轻轻地引导到平台上。无论是否找到平台，都将其在平台上停留15 s，每天进行两次试验。最后1 d，在同一个象限中放置小鼠，测量小鼠上台时间。

1.5.2 大脑生化指标测定

行为学实验结束后，二氧化碳安乐死。每组半数迅速取出小鼠脑海马组织，称重后，置于液氮中保存。匀浆后用试剂盒法测定海马组织脑内乙酰胆碱酯酶（AChE）、乙酰胆碱转移酶（ChAT）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、谷胱甘肽（GSH）。

1.5.3 病理染色

每组剩余小鼠取脑组织用水合氯醛处理、脱水、透明和封固等步骤后，切片（20-30μm厚），做HE染色，并在尼康倒置显微镜下观察并拍摄染色图片，通过Image-Pro Plus 5.0对切片中神经元椎体细胞进行计数。

1.6 统计分析

數据处理采用SPSS16.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料用比率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 人参皂苷Re对东莨菪碱致痴呆小鼠行为学指标的影响

模型组小鼠上台时间（45.28±4.49） s明显高于对照组（23.56±5.71） s，P<0.01。多奈哌齐组、人参皂苷Re低、中、高剂量组小鼠上台时间（41.28±6.82） s、（34.67±5.12） s、（29.86±3.63） s、

（26.32±6.67）s，明显低于模型组，P<0.01。

2.2 人参皂苷Re对小鼠脑中相关生化因子的影响

模型组小鼠脑内海马的MDA、IL-6、TNF-α含量（187.45±10.37）ng/ml、（168.13±9.16）ng/ml、

（123.51±8.19） ng/ml，高于对照组（130.37±12.86） ng/ml、（118.62±7.39）ng/ml、（98.79±10.63）ng/ml，P<0.01;而AChE、ChAT、GSH（187.45±10.37） ng/ml、（167.13±9.16）ng/ml、（183.51±8.19）ng/ml，

低于对照组（236.47±15.88）ng/ml、（221.50±23.18） ng/ml、（237.85±16.73）ng/ml，P<0.01。另外，多奈哌齐组、人参皂苷Re低、中、高剂量组脑中MDA含量分别为（141.30±9.52） ng/ml、（160.48±9.37） ng/ml、（153.45±11.56）ng/ml、（149.20±13.75） ng/ml，IL-6含量分别为（123.11±12.80）ng/ml、（145.72±10.74）ng/ml、（139.72±9.42）ng/ml、

（134±14.83）ng/ml，TNF-α含量分别为（102.49± 8.53）ng/ml、（110.36±10.68）ng/ml、（108.45±7.68）ng/ml、（106.76±9.55）ng/ml，均低于模型组;P<0.01，且高剂量组的降低作用最为显著。而多奈哌齐组、人参皂苷Re低、中、高剂量组脑海马中AChE的含量分别为（229.42±14.68）ng/ml、（203.15±16.85）ng/ml、（211.92±13.78）ng/ml、（224.73±17.94）ng/ml，ChAT的含量分别为（199.11±8.75）ng/ml、（187.42±10.63）ng/ml、（191.75±11.53）ng/ml、（202.15±10.86）ng/ml，GSH的含量分别为（228.16±8.92） ng/ml、（198.14±13.76） ng/ml、（210.75±11.93）ng/ml、（231.59±16.82） ng/ml，高于模型组，P<0.01，且高剂量组的增加作用最为显著。

2.3 人参皂苷Re对东莨菪碱致痴呆小鼠神经组织元的影响

模型组HE染色切片中神经锥体细胞数量（403±27）个明显少于对照组（576±34）个，P<0.01。多奈哌齐组、人参皂苷Re低、中、高剂量组HE染色切片中神经锥体细胞数量（520.67±43）个、（470±25）个、（503±28）个、（545±30）个，明显高于模型组，P<0.01。

3讨论

东莨菪碱会导致野生型小鼠胆碱能下降、炎症和氧化应激反应、脑组织病理学变化[7]，口服人参皂苷Re小鼠上台时间明显降低，说明人参皂苷Re能改善东莨菪碱导致的小鼠学习记忆功能障碍。大脑中AChE、ChAT、GSH水平的降低是导致AD患者认知发生障碍的原因之一，同样MDA是氧化应激反应的脂质氧化产物，它能加剧神经元的损伤[8]。口服人参皂苷Re使小鼠脑内AChE、ChAT、GSH升高，MDA降低。因此，人参皂苷Re的记忆改善作用可能与增强胆碱能、抗氧化功能有关。

东莨菪碱导致C57BL/6J小鼠大脑中皮层出现高水平的IL-6和TNF-α。IL-6和TNF-α作为神经细胞释放的炎症因子，会引起神经炎症反应，引发痴呆。本研究中，给予人参皂苷Re能够显著抑制小鼠脑内IL-6和TNF-α水平，进而保护神经细胞。

综上，人参皂苷Re具有改善C57BL/6J小鼠学习记忆障碍作用，该作用可能与增加AChE、ChAT含量改善胆碱能系统，增加GSH含量的抗氧化作用，及抑制MDA、IL-6，TNF-α的抗炎作用有关，为人参皂苷Re的临床应用提供重要理论基础。

参考文献

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