酶解法制备低值鱼调味料基质的工艺研究

赵敏，杨保卫

(江苏食品药品职业技术学院 酒店学院，江苏 淮安 223003)

我国淡水资源丰富[1]，根据相关资料显示，我国2008年淡水鱼类的总产量约为1998.4万吨，到2015年总产量升至2715.01万吨，而淡水鱼占所有鱼类总产量的比值也从69.8%攀升至88.5%[2-3]。可见不光是淡水鱼产量不断在提升，淡水鱼占我国鱼类总产量的比值也在不断攀升，而在淡水水产中，低值鱼的占比每年都能稳定在15%～20%左右，产量也不容小觑，具有很大的开发潜力[4]。

低值鱼泛指形体较小、可食用部分较少的各式小杂鱼，这类鱼的单种产量均不高，且市场价值都比较低，一般不作为单独种类上市出售，整体利用价值有限，可以理解为“低价值”的鱼，严格意义上来说是缺乏单种整体利用价值，但综合利用起来还是有一定价值的[5]。常见的淡水低值鱼种类有中华鳑鲏(RhodeussinensisGunther)、麦穗鱼(Pseudorasboraparva)、棒花鱼(Abbottinarivularis)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)等[6]。这些淡水鱼总体产量可观，但实际直接产生的经济价值较低，在捕捞后渔民一般将其直接丢弃或者以廉价出售作为禽类饲料、废料，不仅没有带来经济价值而且污染环境、浪费资源。随着食品加工技术的进步，现阶段也有不少关于低值鱼深加工产品的研究，例如鱼粉[7]、鱼糜[8]、鱼松[9]、鱼蛋白水解制品[10]等，但目前的相关研究与低值鱼产量逐年增加、资源浪费严重的现状相比，还存在着极大的不协调。

本研究以低值鱼为原料制备调味料基质，与传统海水鱼制备鱼露的方式不同，淡水低值鱼类更易受腐败菌影响，一般使用加盐发酵法制备淡水水产调味料，但此种工艺下生产的调味料极不稳定。本文拟采用现代酶解技术制备低值鱼调味料基质，首先对比几种单酶对低值鱼蛋白液水解度(degree of hydrolysis, DH，%)的影响，从中选取合适的单酶制剂进行两两复配，最终以复配酶组合形式进行复配酶解实验。利用单因素实验、响应面实验等重点对低值鱼复配酶水解工艺进行优化，提高低值鱼蛋白DH值，酶解所获得的酶解蛋白底液，再通过干燥即可制得调味料基质蛋白粉。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

洪泽湖低值鱼，品种包括中华鳑鲏鱼(身长3～6 cm之间，单体重约5 g)、白条鱼(身长10～20 cm，单体重约15～30 g)、麦穗鱼(身长3～10 cm，单体重约5～10 g)、棒花鱼(身长5～8 cm之间，单体重约5 g)：淮安益地农业发展有限公司提供；碱性蛋白酶(400000 U/g)、中性蛋白酶(270000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、风味蛋白酶(60000 U/g)：江苏锐阳生物科技有限公司；无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钠、95%乙醇：国药集团化学试剂有限公司；甲基红、甲基绿：上海展云化工有限公司；次甲基蓝：天津福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

HH-6型恒温水浴锅 常州润华仪器制造有限公司；DHG-9053A型恒温鼓风干燥机 无锡瑞玛特科技有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；TD5A型低速台式离心机 常州金坛良友仪器有限公司；DS-1型高速组织捣碎机、LP502B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；pHS-3C型精密pH计 上海叶拓科技有限公司；SVAC1-2 SHELLAB真空干燥箱 美国SHELLAB公司；FOSS KJELTEC 2300全自动凯氏定氮仪 珠海市造鑫企业有限公司；RE-1002旋转蒸发仪 上海秉越电子仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

去内脏→清洗→沥干→打浆→酶解→灭酶→离心→反压浓缩→真空干燥→半成品。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 酶解

参照文献[11]的方法，首先进行多种单酶对比实验，在此基础上进行混合酶制剂的复配，酶解过程中生成的苦味物质与酶解时间有关，复合酶的使用有利于缩短酶解时间，从而降低苦味物质的生成量。

1.3.2.2 离心

设置离心转速为5000 r/min，温度为4 ℃进行低温离心，取少量上浮的油脂待用，取上清液，余下沉淀物质待用。

1.3.2.3 反压浓缩

设置真空度为0.1 MPa，压缩温度为83 ℃，蒸发速率约为20 mL/min，不同液体量蒸发速率有差异。

1.3.3 单酶对鱼蛋白水解度的影响

1.3.3.1 不同种类酶制剂的选择

根据现有相关研究，选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶4种蛋白酶进行单酶水解实验，分别在不同酶制剂最适的酶解条件下对比其对低值鱼蛋白水解度(DH，%)的大小[12]。各种酶制剂最适反应条件详见表1。

表1 不同酶制剂的最适酶解条件Table 1 The optimum enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.3.2 水解度测定

参照国家标准GB 5009.5-2016[13]以及梁凯等[14]研究的相关描述，氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法，而总氮含量则采用自动凯氏定氮法测定。

1.3.4 复合酶对鱼蛋白水解度的影响

分别在4种单酶最适的pH环境下进行酶解实验，各实验组鱼蛋白样品中均加入3倍质量的无菌水，控制其他条件不变(时间5 h、温度50 ℃、加酶量1%)，通过对比实验优选出水解效果较好的酶。

组合复配多种酶制剂对蛋白质的酶解作用相较单一酶而言要更显著，水解液的风味受复配酶制剂协同作用的影响较大，一般而言酶制剂种类越多，水解参数越复杂，形成酶解溶液的稳定性也越难把控[15]。故而进行复配酶酶解实验，以水解度为评价指标，酶制剂复配比、复配酶用量、酶解pH、酶解温度这4个因素为自变量，在单因素实验的基础上进行响应面优化实验。

1.3.5 复配酶水解工艺优化

1.3.5.1 复配酶水解单因素实验

在上述预实验的基础上采用控制变量法进行单因素实验，4个单因素的梯度分别设置为：酶制剂复配(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；复配酶用量0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%；酶解pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5以及酶解温度45，50，55，60，65 ℃。固定参数为酶解时间5 h、酶制剂复配比1∶1、复配酶用量1%、酶解pH 7.0以及酶解温度50 ℃。

1.3.5.2 响应面实验优化水解工艺

在单因素实验的基础上进行4因素3水平的响应面实验，优化确定最佳的复配酶水解鱼蛋白工艺参数，因素水平设置详见表2。

表2 响应面因素水平表

1.4 数据分析

运用Design Expert 8.0软件、IBM SPSS Statistics 21.0以及Origin 7.5等软件进行响应面实验设计、统计学分析以及绘图。所有实验均为3次平行实验后的平均值。

2 结果与讨论

2.1 单酶对鱼蛋白水解度的影响

鱼蛋白的水解度受不同单酶制剂的影响见图1，由于酶切点不同，各酶制剂的酶解效果也不一样[16]。

图1 单酶对鱼蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of single enzyme on the degree of hydrolysis of fish protein

由图1可知，各单酶酶解鱼蛋白的总体变化趋势相似，随着酶解时间的延长，DH均呈现上升趋势。其中，对鱼蛋白水解效果最好的是碱性蛋白酶，而最差的是风味蛋白酶，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的效果居中。而且当酶解时间在0～1 h范围内时，鱼蛋白的DH值上升最为显著，当酶解时间超过3 h之后，鱼蛋白的DH值上升趋势逐渐趋于平稳。综合考虑，剔除酶解效果最差的风味蛋白酶，下一步实验选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶这3种酶制剂进行两两复配。

2.2 不同复配酶对鱼蛋白水解度的影响

图2 复配酶对鱼蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

由图2可知，不同复配酶的酶解效果随着酶解时间的延长呈现逐渐增强的趋势，整体趋势与单酶酶解类似，但具体幅度存在差异，当酶解时间在0～2 h范围内时，DH值的上升幅度最大，当酶解时间超过2 h时，随着时间的延长，3组复配酶对DH的增强效果均趋于平缓。其中，中性蛋白酶+木瓜蛋白酶复配组的水解效果最好，水解效果最差的是碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶复配组，碱性蛋白酶+中性蛋白酶复配组水解效果居中。究其原因可能是各个单酶制剂的最佳酶解条件和酶切肽链点各不相同，将不同单酶复配后可能产生协同作用，但也可能产生拮抗作用，所以出现不同单酶复配后酶解效果差异较大的局面[17]。综合考虑，选择木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的组合进行下一步的复配酶解实验。

2.3 复配酶水解鱼蛋白单因素实验

2.3.1 复配酶配比对鱼蛋白DH的影响

图3 复配酶配比对鱼蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of ratios of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

在前期实验的基础上，选择中性蛋白酶+木瓜蛋白酶的复配组合，考察在不同复配比例下对鱼蛋白DH的影响效果。由图3可知，在复配酶(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)配比由1∶1变化至1∶6的范围区间，鱼蛋白的DH值由34.3%下降到28.8%，且呈现逐渐下降的趋势。综合考虑，选择中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶复配配比1∶1～1∶3为下一步响应面优化的实验范围。

2.3.2 复配酶用量对鱼蛋白DH的影响

图4 复配酶用量对鱼蛋白水解度的影响

由图4可知，当复配酶用量由0.25%增加至1.5%时，鱼蛋白的DH值总体呈现逐渐上升的趋势，而且加酶量在0.25%～1%的范围内时，DH值上升幅度较大、速率较快，当加酶量超过1%时，DH值呈现较为平稳的上升趋势，增长速率明显变慢，这是因为当复配酶浓度增加到一定程度时，水解溶液已趋向于饱和状态，鱼蛋白的DH值不会随着加酶量的增加而明显上升。另外，从水解过程成本控制的角度出发，综合考虑后选择复配酶用量0.75%～1.25%为下一步响应面优化的实验范围。

2.3.3 酶解pH对鱼蛋白DH的影响

图5 pH对鱼蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis of fish protein

根据中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的建议反应条件确定复配酶水解鱼蛋白pH值单因素范围为6～8.5。由图5可知，随着pH值的增加，鱼蛋白的DH值呈现先上升后逐渐下降的趋势，在pH值为7时，即溶液达到中性环境时，DH达到最大值，为34.8%；当酶解pH值大于7时，即溶液向碱性趋近时，DH值呈现显著下降趋势(p<0.05)。综合考虑，选择酶解pH值7为下一步响应面实验的中心点。

2.3.4 酶解温度对鱼蛋白DH的影响

图6 温度对鱼蛋白水解度的影响

由图6可知，鱼蛋白DH值随着温度的变化而产生了较大变化，随着温度由40 ℃升高至65 ℃的过程中，DH值的变化呈现先上升后缓慢下降的趋势，这是因为适当的温度能有效提升酶促反应速率，加剧蛋白质水解反应程度[18]，DH值在反应温度为55 ℃时达到最大值35.2%，当温度超过55 ℃时，DH值逐渐下降。综合考虑，选择酶解温度55 ℃作为下一步响应面实验的中心点。

2.4 复配酶水解鱼蛋白响应面优化

2.4.1 响应面设计结果及方差分析

使用Design Expert 8.0软件进行BBD实验组合设计4因素3水平的响应面优化实验，以鱼蛋白DH值为响应值Y，设计方案及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 响应面实验设计及结果Table 3 The design and results of BBD experiments

续 表

表4 方差分析结果Table 4 The results of variance analysis

对实验设计组配的29组数据进行响应面拟合以及统计学分析，可得鱼蛋白的DH值关于所选4个因素的拟合回归方程，具体如下：

Y(DH，%)=34.86-0.98A+0.59B-0.44C-1.12D+0.45AB+0.30AC-1.20AD-0.40BC+0.63BD+0.83CD-0.51A2-2.09B2-2.17C2-1.90D2。

由表3和表4所得数据可知，所构建的模型的p<0.0001，表明该模型极显著，而失拟项的p=0.0731，>0.05，说明失拟项不显著(p>0.05)，模型的拟合程度良好，该回归方程可用于描述复配酶配比(A)、加酶量(B)、酶解pH值(C)以及酶解温度(D)和鱼蛋白水解程度的关系。方差分析结果显示相关系数R2=0.9486，远大于0.9，说明模型预测值与真实值的相关性很高[19]。比较F值大小可得，4个因素中，对鱼蛋白DH值影响程度的大小依次为D>A>B>C，与单因素实验结果契合，其中一次项A、B、D和二次项B2、C2、D2极显著(p<0.01)，而显著项有一次项C和交互项CD(p<0.05)，其余各项不显著(p>0.05)。

2.4.2 响应曲面与等高线分析

Box-Behnken响应面优化法在生物培养基优化、药剂制备以及食品加工工艺优化中已被广泛应用。3D响应曲面直接显示出了各因素对鱼蛋白酶解工艺的影响趋势，而平面等高线图中线与线之间的疏密度则表现了两个不同因素交互对鱼蛋白酶解工艺的影响程度，3D曲面图坡度越陡、等高线呈椭圆形且越密集，说明该交互项对鱼蛋白酶解工艺的影响越大[20]。呈显著性的交互项等高线图及响应曲面图见图7。

a

b

由图7可知，图7中b的响应面坡度较图7中a的要陡峭，且等高线也较为密集，这说明复配酶配比、酶解温度这两个因素之间的交互对鱼蛋白酶解工艺的影响最为显著，这与表4中方差分析所显示的结论一致。而其余各因素之间的3D响应曲面图、等高线图较为稀疏。

2.4.3 复配酶最佳水解工艺及验证

使用Design Expert 8.0软件对响应面实验结果进行最终优化求解，将目标值鱼蛋白的DH设为最大值，所得复配酶最佳水解工艺见表5。

表5 复配酶最佳水解工艺

软件显示第一组的酶解工艺参数最优，在此参数下进行5组平行实验，最终得到的DH值为35.41%的可能性高达93.5%。根据实际操作情况，确定复配酶水解鱼蛋白的工艺参数为：复配酶配比1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解温度55 ℃，在此条件下再进行验证实验，最终结果显示鱼蛋白的DH值为(35.32±0.21)%，与预测值的差异仅为0.25%，由此可验证本研究所得的理论模型与实际情况有较好的拟合度，能有效地反映出复配酶配比、加酶量、酶解pH以及酶解温度等因素与鱼蛋白DH值的关系，可用于指导复配酶水解鱼蛋白的实际生产。

3 结论

本研究用现代酶解技术制备低值鱼调味料基质，首先对比了中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶这4种单酶对鱼蛋白DH值的影响，选取了碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶这3种酶制剂进行两两复配，最终选择木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的组合进行复配酶解实验。以鱼蛋白的DH值为目标值，在单因素实验的基础上进行响应面实验，优化低值鱼蛋白复配酶水解工艺，响应面实验所得模型拟合程度良好(p<0.0001)，得出最终的最优水解工艺参数为：复配酶配比(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解温度55 ℃。验证实验证明，在此工艺条件下进行水解，鱼蛋白DH值最高，为(35.32±0.21)%，较优化之前的各组有显著提升(p<0.05)。该研究为酶解法制备低值鱼调味料基质提供了科学指导，不仅对价值较低的鱼类资源进行了有效利用，而且对丰富调味品市场的产品种类提供了新方向。