葛藤茎挥发油成分分析及葛根总黄酮提取工艺研究

唐婷范，朱家庆，周萌琳，黄芳丽，黄华杰，程昊

(广西科技大学 生物与化学工程学院 广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006)

葛根和葛藤茎具有较高的营养价值，其蕴含丰富的活性成分，对人体大有裨益。一株完整的葛藤包括茎、叶、花、果四部分，靠近根部的葛藤茎属于茎叶中最为粗壮的部分，为半木质化状态，可供药用。现挖掘出的葛根和葛藤茎的活性成分有挥发油类和黄酮类等[1-3]。仰玲玲等[4]在野葛藤茎内发现153个挥发油成分，并成功鉴定出64个，其中以烷酸和烯酸类化合物含量最高，占鉴定出成分的69.72%。葛根在心脑血管方面的功效得益于其含有的黄酮类化合物尤其是葛根素，能活化血管的管壁，增强血管的扩张能力和韧性，改善大脑血液循环活动，预防因血小板凋亡或局部凝集引起的血栓等[5]。Wang等[6]的研究结果显示，葛根素能够使破骨细胞进行骨吸收时被抑制，胎鼠体外的骨发育能力得到增强，从而进一步证明葛根素具备促进大鼠成熟骨细胞的增殖和分化的作用。

当前，中外对葛根的化学活性成分钻研主要聚集在葛藤根部上，对此已有较多研究成果，而对葛藤茎部则研究有限，在对葛根的采收上，葛藤茎无不是被当作无效部位而丢弃，这何尝不是另一种资源的浪费[7]。另外，黄酮的提取方法多种多样，有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法等[8-10]。所以，有必要对葛藤茎挥发油类物质以及葛根中黄酮物质提取进行研究探索，明确葛藤茎的挥发油成分及研究葛根的提取工艺的重要意义，为以后研发新的葛根及葛藤茎产品提供理论依据。因此，实验选取新鲜葛藤茎和葛根，以水蒸气蒸馏法提取新鲜葛藤茎的挥发油，采用气相色谱-质谱联用(GC/MS)分析鉴定其化学组分[11]。另外，以总黄酮的得率为指标，采用超声波辅助提取葛根总黄酮。通过单因素实验考察对黄酮得率的影响，并选用正交实验，确定葛根总黄酮的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根及葛藤茎：广西北海；芦丁：南京奥多福尼生物科技有限公司；无水乙醇：成都市科龙化工试剂厂；亚硝酸钠、三氯化铁：台山市粤侨试剂塑料有限公司；无水碳酸钠、浓硫酸：广东光华科技股份有限公司；乙醚、氢氧化钠、六水合氯化铝、无水硫酸钠、九水合硝酸铝：西陇科学股份有限公司。

JJ200电子天平 常熟市双杰测试仪器厂；AR124CN分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；GZX-GF101-4-S电热恒温鼓风干燥箱 上海锦屏仪器仪表有限公司；V2000可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Trace 1300气相色谱仪、ISQ QD单四极质谱仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根原料预处理

选取新鲜葛根洗净切片，烘箱烘干后研磨成粉末过20目筛，利用乙醇水溶液进行超声辅助提取，抽滤后取上清液备用。

称取剪碎的新鲜葛藤茎100 g，按固液比1∶10(g/mL)加入蒸馏水，用挥发油提取器进行提取，持续提取12 h，蒸出液用乙醚萃取，以无水硫酸钠干燥，过滤后密封保存。

1.2.2 挥发油类物质及黄酮类化合物检测[12]

GC/MS条件：毛细管色谱柱HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气，流量1.0 mL/min；程序升温：初始温度为75 ℃，保持3 min后按8 ℃/min的速率升至220 ℃，汽化室温度260 ℃；分流比25∶1；进样口温度为280 ℃，进样量为1 μL。EI电离源，电子能量70 eV，接口温度280 ℃，电子倍增器电压1.5 kV，质量扫描范围50～550 amu，扫描方式为全扫描方式。

称取2 g研磨后的葛根粉，加入60 mL 60%的乙醇，50 ℃超声提取20 min，冷却后抽滤，滤液定容到100 mL容量瓶中，获得粗黄酮提取液。取洁净的试管，分别向其中加入1.0 mL提取液，再分别向试管中加入少量的FeCl3、AlCl3、NaOH、Na2CO3、浓硫酸试剂，摇匀等待，观察其显色反应。

1.2.3 标准曲线的绘制[13]

首先称量10 mg芦丁标准样品于干净的烧杯中，加入60%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL的芦丁标准溶液；再分别量取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL 0.2 mg/mL的芦丁标准液至10 mL容量瓶中，用60%乙醇补足至5.0 mL，摇匀后向容量瓶中加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min，再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液定容至刻度线，摇匀静置15 min后备用；最后在510 nm处测定其吸光度值并绘制标准曲线。

1.2.4 精密度、稳定性和加标回收率实验

精密度实验：取葛根黄酮提取液2.0 mL，按照1.2.3进行操作，用分光光度计连续测定5次其吸光度。

稳定性实验：取葛根黄酮提取液2.0 mL，按照1.2.3进行操作，每间隔2 min测量提取液的吸光度值变化情况。

加标回收率实验：分别取葛根黄酮提取液2.0 mL定容至10 mL容量瓶中，再依次加入不同体积的芦丁标准溶液，测定溶液的吸光度，计算其加标回收率。

1.2.5 葛根提取物总黄酮得率计算[14-15]

总黄酮得率的计算公式如下：

式中：A为溶液吸光度，V固液比为对应固液比的体积。单因素实验及正交实验均用此计算公式。

1.2.6 单因素对葛根总黄酮得率的影响

以葛根总黄酮得率为指标，采用单因素实验研究乙醇浓度、固液比、超声时间、超声输出功率、提取温度对得率的影响。实验水平分别选取乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%；固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)；超声时间20，40，60，80，100 min；超声输出功率200，250，300，350，400 W；提取温度40，50，60，70，80 ℃。对影响因素进行初步优化，确定较佳因素实验参数范围。

1.2.7 正交实验的建立

以单因素实验的结果为依据，从乙醇浓度、固液比、超声时间、超声输出功率、提取温度5个因素中，选中因素的最优条件和相邻的两个条件进行正交实验，正交实验因素水平的选取见表1。

1.2.8 数据处理

利用Excel 2019和Origin 2018进行数据处理与分析，每次测3次，取平均值计算，并绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 GC/MS结果分析

葛藤茎挥发油总离子流图见图1。

图1 葛藤茎挥发油总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oils fromPueraria lobata stems

使用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)对葛藤茎挥发油进行总离子质谱检测，用计算机对各峰质谱图在质谱库NIST17 Search和AMDIS中进行标准谱库的检索并结合质谱裂解规律，鉴定出10种主要的组分，并利用峰面积归一化法计算出各组分的相对含量，结果见表2。鉴定出的组分占总体的83.94%，其中醇类(5个，见表2中序号3，4，5，6，7)占49.68%，酯类(2个，见表2中序号9，10)占15.85%，烷类(2个，见表2中序号1，2)占5.81%，酚类(1个，见表2中序号8)占12.60%。

表2 葛藤茎挥发油成分及相对含量Table 2 Components and relative content of volatile oils from Pueraria lobata stems

由此可看出构成该葛藤茎的挥发油成分以醇类和酯类为主，尤其蓝桉醇的含量最高，达到了31.30%，葛藤茎散发的香味可能也与富含醇类与酯类有关。

2.2 黄酮类化合物检测结果分析

表3 显色反应结果分析Table 3 Analysis of chromogenic reaction results

由表3可知，葛根粉的提取液与黄酮类物质的显色反应现象相似，多数黄酮类化合物都含有酚羟基，可与氯化铁溶液发生阳性反应而显色。在碱性试剂，如氢氧化钠、碳酸钠溶液中被开环，羟基被氧化而显色。还与铝盐发生络合反应而显色等，故可以得出葛根提取物中含有黄酮类化合物的结论。

2.3 芦丁标准曲线方程结果分析

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

由图2可以计算出标准方程式为：Y=11.146X-0.006，相关系数R2=0.9992，说明在浓度范围0.01～0.07 mg/mL之间，线性关系良好。

2.4 精密度、稳定性和加标回收率结果分析

表4 精密度实验结果分析Table 4 Analysis of precision experiment results

表5 稳定性实验结果分析Table 5 Analysis of stability experiment results

由表4可知，精密度实验的RSD值为0.227%，表明该方法精密度较好。由表5可知，20 min内葛根黄酮提取液的平均吸光度为0.241，相对标准偏差(RSD)为1.23%，说明该方法的稳定性良好。

表6 加标回收率实验结果分析Table 6 Analysis of recovery rate experiment results

由表6可知，葛根黄酮提取物的平均加标回收率为98.64%，相对标准偏差(RSD)为1.86%，表明该方法真实可靠，可用于测量葛根中总黄酮含量。

2.5 单因素实验结果分析

2.5.1 乙醇浓度对总黄酮得率影响结果分析

由图3可知，葛根总黄酮的得率受乙醇浓度影响较大，随着乙醇浓度的上升，得率也随之上升，这是由于乙醇浓度增大，黄酮类化合物的溶解量也随之增大，在乙醇浓度为40%时得率最大，达到0.795%，随后乙醇浓度继续增加得率反而减小，这可能是由于葛根总黄酮也有部分水溶性的成分存在，在较高的提取介质中溶解量下降，影响了得率。故选择40%乙醇作为葛根总黄酮的最佳提取介质浓度。

2.5.2 固液比对总黄酮得率影响结果分析

图4 固液比对葛根总黄酮提取的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由图4可知，固液比对总黄酮得率也有较大影响，固液比的增大促进了总黄酮得率的提高。在一定的温度下，总黄酮的溶解量有限，当增大固液比时，总黄酮的得率也随之提高，当固液比达到1∶30(g/mL)时，溶解量达到最大，得率也达到了最大值0.813%，继续增大固液比得率反而下降，可能是在该温度下植物细胞壁未被破坏，总黄酮的溶解量不再增大反而被稀释，综合之下，确定葛根总黄酮的最佳提取固液比为1∶30(g/mL)。

2.5.3 超声时间对总黄酮得率影响结果分析

图5 超声时间对葛根总黄酮提取的影响Fig.5 Effects of ultrasonic time on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由图5可知，在20～60 min内，总黄酮得率相对平缓，但总体仍随超声时间的延长而上升，在60 min时达到最大值，为0.762%，而后得率下降，这可能是由于长时间的超声作用使得大量细胞壁被破坏，大量物质被溶出并糅杂在一起，从而影响了总黄酮得率。因此，选择最佳的总黄酮超声提取时间为60 min。

2.5.4 超声输出功率对总黄酮得率影响结果分析

图6 超声功率对葛根总黄酮提取的影响Fig.6 Effects of ultrasonic power on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

由图6可知，随着功率的增大，总黄酮也随即被加速溶出，总黄酮得率在功率为300 W时达到最大值，为0.816%，但随功率继续增大得率反而降低，这可能是由于功率增大后，原先无法浸出的其他干扰物质被加速浸出，大大降低了得率，故选择300 W作为最佳的总黄酮提取功率。

2.5.5 提取温度对总黄酮得率影响结果分析

由图7可知，随着温度的逐渐升高，得率逐渐上升。这是由于温度的升高会使黄酮类物质的溶解量和浸出速率都有所提高，但温度继续提高时，得率趋于平缓，这可能是由于温度过高使得部分黄酮类化合物被破坏，同时加速了细胞内的非有效成分浸出，故选择70 ℃作为总黄酮的最佳提取温度。

图7 提取温度对葛根总黄酮提取的影响Fig.7 Effects of extraction temperature on extraction of total flavonoids from Pueraria lobata roots

2.6 正交实验结果与分析

表7 实验方案及实验结果Table 7 Experimental scheme and results

由表7可知，超声时间和固液比对葛根总黄酮的提取影响很大，超声功率对总黄酮的提取影响较小，由极差R分析可知，对黄酮得率的影响次序为固液比>超声时间>提取温度=乙醇浓度>超声功率，正交实验以总黄酮得率为评价指标，通过对比各个因素的指标之和K1、K2、K3的最大值可知，最优组合为A3B2C1D3E3，最优工艺为：提取温度80 ℃、乙醇浓度40%、超声时间20 min、固液比1∶50(g/mL)、超声功率300 W。

3 结论

由实验分析结果可知，醇类化合物是新鲜葛藤茎中最主要的挥发性成分，占49.68%，其次为酯类化合物，占15.85%，酚类占12.60%，烷类占5.81%。另外，利用黄酮类化合物的显色反应现象对葛根中黄酮类物质进行分析判定。选取芦丁为标准样品，以亚硝酸钠-硝酸铝法作为显色分析方法，通过分光光度计测量其吸光度值并绘制标准曲线，测定的标准曲线方程为：Y=11.146X-0.006，标准曲线的线性范围是0.01～0.07 mg/mL，加标回收率的RSD为1.86%。并以此计算葛根中总黄酮的含量。基于单因素实验结果采用正交实验法，优化葛根中总黄酮的提取工艺，在此工艺下总黄酮的最高得率可达1.47%。