草鱼肠道乳酸菌的分离鉴定及适用性能评价

肖 俊，张桂芳，李艳芳，丁立云，徐先栋，傅义龙，饶 毅

（江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039）

肠道微生物在鱼类生长过程中起着非常重要的作用，其平衡状态关系到鱼类机体的健康。正常的肠道微生物菌群对鱼体有营养、免疫调节和抑制病原菌等作用。有研究表明，鱼饲料中添加益生菌可以提高鱼类生产性能和饲料利用率，增强免疫能力。

发酵中草药是将中草药以一种或多种优选的益生菌作为菌种，在体外模拟肠道环境和中药成分在体内的消化分解过程，对提取的中药有效成分进行生物学转化[1]。已有的研究证明发酵中草药在促生长、增强水产动物非特异性免疫能力等方面优于未发酵的中草药[2-3]。中草药经益生菌发酵后，产生了更多的抑菌活性物质，中草药中的营养物质有利于菌体的生长，因此益生菌和中草药的协同作用使抑菌活性得到了增强[4]。目前的研究大部分都是集中在外源益生菌发酵中草药上，从宿主体内分离益生菌发酵中草药的研究还很少。研究表明从宿主体内筛选的益生菌能更好的适应宿主体内的环境并在宿主体内定殖[5]，因此筛选原籍益生菌至关重要。试验从健康的草鱼肠道中分离原籍乳酸菌，确保菌株能很好地适应草鱼肠道的环境，发挥菌株的益生性，并对其生长、耐酸、耐盐能力进行分析，旨在筛选出性能稳定、益生性好的菌株，为以后研究发酵中草药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼试验用草鱼来自江西省水产科学研究所试验基地鱼池，平均体重约为450 g，体质健壮。

1.1.2 培养基与试剂MRS 液体培养基、MRS 固体培养基、TaKaRa 细菌基因组DNA 提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司、16SrDNA 基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司、HCl、NaOH、胆盐等。

1.2 试验方法

1.2.1 肠道乳酸菌的分离草鱼肠道乳酸菌分离在超净工作台内进行。将鱼放在白色托盘中，用75%酒精擦拭鱼体表，剖开鱼腹，取出肠道。纵向剪开肠道，用PBS 缓冲液冲洗掉肠内粪便，取少许肠道剪碎并用无菌生理盐水冲洗2～3 次，放入MRS 液体培养基中30℃富集培养24 h。将富集培养液按 10-1 梯度稀释至10-7 ，各取100 μL 稀释液涂布含1% CaCO3的MRS固体培养基，30℃倒置培养48 h。挑取有溶钙环的单菌落，再次划线接种于MRS 固体培养基纯化。取2次纯化后的菌落进行革兰氏染色。

1.2.2 细菌的16S r DNA 序列测定按TaKaRa 细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，并以其为模板进行 PCR 扩增，引物为通用引物，反应体系为25 μL 体系。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对。

1.2.3 耐酸、耐胆盐能力测试将鉴定为乳酸菌的菌株进行耐酸、耐胆盐能力测试试验，测试方法参照向双云[6]的方法进行。

耐 酸 能 力 测 试 用1mol/L 的HCl 和1 mol/L 的NaOH将MRS液体培养基的pH值分别调节成2.0、3.0、4.0 共3 个处理组，将菌株按1%的接种量分别接种于3 个处理组中，每个处理组设3 个平行，30℃处理3 h，以不调节pH 值的MRS 液体培养基为对照。处理完毕后，每个处理组和对照组的菌液10 倍稀释至合适的稀释度，取3 个合适稀释度菌液100 μL 分别涂布于MRS固体培养基，30℃培养24 h后计数菌落数，记录结果，每个处理计算平均菌落数。试验结束后按公式（1）计算乳酸菌的存活率。

存活率（%）=（处理组平均活菌数 / 对照组平均活菌数）×100 （1）

耐胆盐能力测试 在MRS 液体培养基中分别加入0.1%、0.2%、0.3%浓度的胆盐后成3 个处理组，将菌株培养24 h 后的菌液按5%（v/v）接种于3 个处理组中，每个处理设3 个平行，30℃处理3 h，以不添加胆盐的MRS 液体培养基为对照。处理完毕后，按耐酸能力测试的方法进行平板菌落计数，计算乳酸菌的平均存活率。

1.2.4 生长曲线测定将耐酸、耐胆盐能力强的菌株按1%的比例接种于MRS 液体培养基，30℃培养24 h，设3 个平行。从第2 h 开始，每隔2 h 取样测定其OD600，以MRS 液体培养基为空白对照，记录数据绘制生长曲线。

1.2.5 安全性测试将待测乳酸菌接种于MRS 液体培养基，30℃培养12 h 至指数期后，10 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水重悬，再离心洗涤一次，最后制成浓度为108 CFU/mL 的菌悬液。选取体重为50.5±4.5 g 的健康草鱼，分成10 尾一组。试验组每尾草鱼经胸鳍基部注射0.2mL 菌悬液，设3个平行，对照组注射0.2 mL 无菌生理盐水。注射后连续观察7 d，统计各组草鱼的存活状况。

1.2.6 抑菌能力测试测试方法参照向双云[6]的方法设计。选取大肠杆菌和维氏气单胞菌为指示菌。在营养琼脂平板上注入0.1 mL 指示菌菌液，用涂布器涂布均匀。在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基表面接触无空隙。在杯中加入待测菌菌液，每株菌液做3 个平行。置于4℃冰箱中处理1 h后，再30℃培养24 h，观察结果。以牛津杯周围没有肉眼可见细菌生长区域为抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，取3 个平板的平均值。根据抑菌圈平均值判断乳酸菌对大肠杆菌的敏感性。抑菌圈直径小于10 mm 为不敏感，10～15 mm 为中度敏感，15 mm 以上为高度敏感。

1.2.7 药敏测试按上述安全性测试的方法将待测菌株制成浓度为106 CFU/mL 的菌悬液，取100 μL 分别涂布于MRS 固体培养基上。采用药敏纸片扩散法，将纸片无菌操作均匀置于培养基上，30 ℃培养24 h 后，测量各药敏纸片抑菌圈的直径，重复3 次试验。根据敏感性标准判定各药物对菌株的敏感性。

1.3 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差表示，采用统计软件SPSS16.0 对数据进行单因素方差分析，并进行显著性检验，P＜0.05 为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定

从草鱼肠道中分离出12 株乳酸菌，它们在MRS平板上的形态基本一致，均为圆形，乳白色，表面光滑湿润，革兰氏染色判定为阳性菌。16S r DNA序列测序结果显示，其中8 株乳酸菌属于乳球菌属（Lactococcus），分别是6 株乳酸乳球菌（L.lactis），2 株格氏乳球菌（L.garvieae），4 株肠球菌属（Enterococcus），均为粪肠球菌（E.faecalis）。格氏乳球菌为致病菌，乳酸乳球菌和粪肠球菌为益生菌，因此，选取2 株具有较强产酸能力的乳酸乳球菌（CR1、CR2）和2 株粪肠球菌（CR3、CR4）进行益生效果评价。

2.2 乳酸菌生长曲线

从图1 可以看出，试验选取的4 株乳酸菌均于4 h 后进入对数生长期，OD600值快速上升，8 h 后生长达到高峰，进入生长稳定期。乳酸乳球菌CR1、CR2生长速率较粪肠球菌CR3、CR4 快，且4 h 后差异显著（P＜0.05），表明乳酸乳球菌CR1、CR2 的生长性能相对较好。

图1 乳酸菌的生长曲线

2.3 乳酸菌耐酸能力测定

从图2 可以看出，试验选取的4 株乳酸菌在pH值为4.0 的条件下存活率均在80%以上，差异不显著（P＞0.05），随着pH 值的降低，菌株的存活率均显著下降，在pH 值为2.0 的条件下，菌株CR1、CR2、CR3 的存活率平均为26%、22%、30%，差异不显著（P＞0.05），菌株CR4 的存活率为0，显著低于CR1、CR2、CR3（P＜0.05），表明CR4 对酸的耐受能力较弱。

图2 乳酸菌对酸的耐受试验

2.4 乳酸菌耐胆盐能力测定

从图3 中可以看出，试验选取的4 株乳酸菌存活率随胆盐浓度增加而降低，其中，菌株CR2 的存活率显著低于CR1 和CR3（P＜0.05），在胆盐浓度增加到0.3%时，CR2 的存活率低于10%，表明菌株CR2 对胆盐耐受能力较差。

图3 乳酸菌对胆盐的耐受试验

2.5 乳酸菌安全性测定

注射乳酸菌菌悬液后，4 株乳酸菌试验组和对照组草鱼都未出现死亡，将试验鱼解剖，发现试验组和对照组草鱼内脏均正常无病变，表明4 株乳酸菌都安全。

2.6 乳酸菌抑菌能力测试

从表1 中可以看出，4 株乳酸菌对大肠杆菌均表现了高度敏感的抑制效果。CR1 和CR4 对维氏气单菌也表现出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 对维氏气单菌为中度敏感。

表1 4 株乳酸菌菌株的抑菌能力测试结果

2.7 乳酸菌药敏测试

从表2 中可以看出，4 株乳酸菌对不同的抗生素表现出了不同的敏感性。菌株CR1 对9 种抗生素中的7种敏感，对恩诺沙星中度敏感，仅对丁胺卡那耐药。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都仅对其中4～5 种抗生素敏感，对恩诺沙星、头孢他啶和丁胺卡那都表现出不同程度的耐药性。

表2 乳酸菌药敏测试结果

3 讨 论

3.1 乳酸菌分离鉴定

乳酸菌是水产动物消化道中的亚优势种，具有调节肠道菌群、增强机体免疫力等益生作用[7-9]。目前已有较多研究从鱼肠道中分离得到乳酸菌，如杨媛媛等[10]从健康鲫鱼肠道内分离鉴定出38 株乳酸菌，分别属于乳球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌和肠球菌属；Soltani 等[11]从波斯鲟的肠道中分离鉴定出47 株乳酸菌，分别为乳酸乳球菌、韦斯氏菌、戊糖片球菌和粪肠球菌；Ring 等[12]从大西洋鲑鱼、嘉鱼等4 种鱼肠道中分离鉴定出11株乳酸菌株，均属于肉食杆菌。从以上研究中看出，不同的鱼肠道中分离出的乳酸菌有些相同有些也存在差异，本研究从草鱼肠道中分离出的12 株乳酸菌分别属于乳球菌属和肠球菌属，与以上的研究也不尽相同，这可能是由于研究者的研究方法存在差异，也与鱼类的食性以及生存环境有很大的关系。

3.2 乳酸菌生长特性

肠道中乳酸菌只有达到一定数量的时候，才能改善和调节宿主体内微生物菌群的平衡，产生对宿主健康有益的作用[13]，不同来源的乳酸菌的生长速度会有差异，同一来源的乳酸菌由于菌株本身的特性，在生长速度上也会有所不同[6]，所以生长速度也是乳酸菌产生作用的重要条件之一。杨静等[14]研究表明植物乳杆菌及粪肠球菌分别培养了6 h 和8 h 后进入对数生长期，分别于18 h 和16 h 后吸光值达到最大；王红涛[15]的研究也发现干酪乳杆菌与屎肠球菌分别于4 h和8 h 进入对数生长期，分别于30 h 和12 h 后进入稳定期。研究中选取的乳酸菌于4 h 后进入对数生长期，8 h 后进入生长稳定期，对比上述研究来看生长速度均比较快。4 株乳酸菌中CR1、CR2 生长速率较CR3、CR4 快，表明CR1、CR2 显示了更好的生长特性。

3.3 乳酸菌耐酸耐胆盐

耐酸和耐胆盐能力是影响乳酸菌发挥益生功效的重要影响因素，乳酸菌必须具有较强的耐酸能力才能顺利通过胃中的酸性环境而到达肠道中发挥其益生功能[16]，进入小肠将会面临高浓度的胆盐环境，高浓度胆盐会破坏细胞膜正常结构，导致膜蛋白解离，使细胞内容物渗漏而造成细胞死亡[17]。从耐酸耐胆盐试验结果可以看出，从草鱼肠道分离出的乳酸菌都能很好的适应肠道环境，但在低pH 值以及高胆盐胁迫下，菌株的耐酸耐胆盐能力还是会出现显著差异，这与邹建华等[18]的研究结果相似。

3.4 乳酸菌抑菌能力

对致病菌的抑制作用也是评价乳酸菌产生作用的重要条件之一。乳酸菌会产生大量的有机酸、过氧化氢、细菌素等多种物质来抑制致病菌的生长[19-20]，同时促进肠道蠕动，加速病原菌排除体外[21-22]，从而可以起到调节肠道微生物生态平衡、维护肠道健康等作用。Sahoo 等[23]研究从南亚野鲮和真卡特拉鲃肠道分离获得的5 株乳酸菌的抑菌能力，发现其对大肠杆菌、嗜水气单胞菌等8 株指示菌均有很强的抑制作用；高擎等[24]研究报道，11 株乳酸菌对大肠杆菌 K88、K99、鸡白痢沙门菌指示菌均有不同程度的抑制作用。本研究用大肠杆菌和维氏气单胞菌对4 株乳酸菌进行抑菌能力测试，结果显示4 株菌株对大肠杆菌均有很强的抑制作用，CR1 和CR4 对维氏气单菌也表现出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 对维氏气单菌仅为中度敏感。说明从草鱼肠道分离的4 株乳酸菌和其他大部分乳酸菌一样，对常见病原菌具有抑制作用。

3.5 乳酸菌药敏测试

耐药性评价是益生乳酸菌应用安全性评价的首要内容[25]。乳酸菌的耐药性有其有利的一面，如乳酸菌和抗生素一起使用时，可使乳酸菌存活于宿主肠道，帮助宿主恢复肠道菌群平衡[26]。但其耐药基因可以各种方式在肠道菌群间相互传递，从而导致致病菌也获得耐药性，危害宿主健康[27]。该研究分离的4 株乳酸菌对不同的抗生素表现出了不同的敏感性。菌株CR1对9 种抗生素中的7 种敏感，对恩诺沙星中度敏感，仅对丁胺卡那耐药。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都仅对其中4～5 种抗生素敏感，对恩诺沙星、头孢他啶和丁胺卡那都表现出不同程度的耐药性。近年来，抗生素和有益菌的联合或配合应用已成为饲料添加剂研究的热点。恩诺沙星是目前水产养殖生产中较常用于治疗细菌性疾病的内服药，研究分离的乳酸菌对恩诺沙星存在一定程度的耐药性，在治疗过程中不会被杀灭，可作为益生菌应用到实际生产中。

4 结 论

从草鱼肠道分离了4 株乳酸菌，对其生长速度、耐酸、耐胆盐、安全性、抑菌能力和药物敏感度进行测试。结果表明4 株乳酸菌中，乳酸乳球菌CR1 具有较好的益生特性，可作为发酵渔用中草药饲料添加剂的益生菌。