玉米甲硫氨酸合酶基因METS的克隆及表达特性

任莹 连通 张春义 姜凌

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

在蛋白质合成过程中，甲硫氨酸起着非常重要的作用，它不仅是蛋白质合成的基础，而且是甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的前体［1］。叶酸是一种非常重要的水溶性B族维生素，作为一碳单位的供体参与很多代谢反应［2］。甲硫氨酸合酶是产生甲硫氨酸和四氢叶酸的关键酶，以5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸作为底物，通过甲硫氨酸代谢途径生成甲硫氨酸和叶酸［3］。人体长期缺乏甲硫氨酸和叶酸会增加脂肪肝、动脉粥样硬化、神经系统疾病和肿瘤发生的概率，甚至会导致结直肠癌和乳腺癌的发生［4］。甲硫氨酸和叶酸主要从植物性膳食中摄取，但它们在作物种子中含量相对不高，特别是甲硫氨酸在豆类植物（如大豆和豌豆等）种子中的比例尤其不足［5］。以植物为主的膳食，其甲硫氨酸的含量只有平衡膳食所需量的50%-75%［6］，叶酸的摄入量也只有世界卫生组织推荐摄入量的45%-75%［7］。

玉米（Zea mays L.）是我国主要经济粮食作物之一，是我国种植面积最大的粮食作物［8］。因此，了解玉米甲硫氨酸的积累及其如何影响种子的萌发对提高玉米籽粒品质和种子萌发率具有重要意义。

甲硫氨酸作为叶酸代谢与含硫氨基酸代谢的连接点，如何提高作物中的含量也被广泛研究［9-17］。目前，研究者提高作物中甲硫氨酸含量并改善种子的营养品质主要是通过过表达种子特异、富含甲硫氨酸的贮藏蛋白，减少缺乏甲硫氨酸的贮藏蛋白，沉默甲硫氨酸分解酶，或者上调参与甲硫氨酸合成的关键生物合成酶［9-13］。如，在马铃薯和拟南芥中通过RNA干扰降低了苏氨酸合成酶（threonine synthetase，TS）转录水平，导致甲硫氨酸水平显著增加30倍和47倍［10-14］；在亚麻中过表达O-乙酰丝氨酸裂解酶（O-acetylserine（thiol）-lyase，OASTL），甲硫氨酸含量增加3-8倍［15］；在拟南芥中过表达甲硫氨酸-S-腺苷转移酶（methionine-sadenosyltransferase，MMT）和同型半胱氨酸-S-腺苷转 移 酶（homocysteine-s-adenosyltransferase，HMT）都可以检测到甲硫氨酸含量的增加［16］；过表达拟南芥胱硫醚 γ-合酶（cystathionine γ-synthase，CGS）的马铃薯块茎中的甲硫氨酸含量是野生型块茎的2倍［17］；在水稻中组成型过表达大肠杆菌丝氨酸乙酰转移酶（serine acetyltransferase，SAT）导致游离蛋氨酸增加40%，而蛋白质中的甲硫氨酸显著增加了近5倍［18］；在大豆中引入富硫蛋白质的合成基因，种子中甲硫氨酸和半胱氨酸分别显著增加16%和66%［19］。不过在马铃薯中过表达编码甲硫氨酸合酶的基因，甲硫氨酸水平没有发生显著变化［20］。

近年来，对于甲硫氨酸合酶的研究主要来自模式生物拟南芥和烟草。拟南芥的甲硫氨酸合酶被认为同时存在于叶绿体和细胞质中，分别参与甲硫氨酸的从头合成与甲基代谢［21］。在烟草花中，甲硫氨酸合酶的转录物积累模式与甲基转移酶的转录物积累模式完全匹配［22］。其他研究表明，甲硫氨酸对拟南芥种子的萌发也非常重要。参与甲硫氨酸代谢的酶丰度在萌发期间迅速增加［23］。甲硫氨酸也可能通过腺苷甲硫氨酸促进乙烯和多胺的合成，进一步促进种子萌发和幼苗生长［24］，同时可以激活拟南芥谷氨酸受体同源物AtGLR 3.5 Ca2+通道，促进Ca2+内流，使胞质内Ca2+浓度升高，抑制ABA不敏感转录因子（ABSCISIC ACID INSENSITIVE 4）表达，降低种子对ABA的敏感性，促进种子萌发，最终使种子萌发率升高［25］。

目前，关于作物甲硫氨酸合酶基因的功能研究鲜见报道，急需开展作物中甲硫氨酸和叶酸的积累机制的研究。本研究拟克隆玉米甲硫氨酸合酶编码的3个同源基因METS1、METS2和METS3，在组织表达特性和萌发过程中，运用实时荧光定量PCR方法对其进行分析，为深入研究甲硫氨酸合酶在玉米籽粒甲硫氨酸和叶酸积累过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料为玉米自交系B73，由中国农业科学院生物技术研究所保存，2021年4月种植于中国农业科学院生物技术研究所试验田（河北省廊坊万庄）。取B73的根、茎、叶、雄穗、幼嫩雌穗和授粉后25 d的籽粒、胚及胚乳，用液氮迅速冷冻，-80℃保存。取B73玉米干种子于25℃纯净水中进行萌发，取萌发时间为0、12、24、36、48、60和72 h的籽粒于液氮中速冻，-80℃保存。

1.1.2 试验试剂 总RNA提取试剂盒购自百奥曼科技有限公司；反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；高保真DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、pEASY®-Blunt Cloning Kit、实时荧光定量TransStart Top Green qPCR SuperMix购自全式金生物技术有限公司；大肠杆菌感受态T1购自全式金生物技术有限公司。引物（表1）合成及测序由华大基因完成。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 ZmMETS的克隆 提取B73叶片的总RNA，并反转录成cDNA，以此为模板扩增ZmMETS。扩增后的产物经电泳回收后，与克隆载体pEASY®-Blunt连接，提取阳性克隆质粒，并测序验证序列是否为目的序列。

1.2.2 ZmMETS的生物信息学分析 利用ProtScale程序（https://expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析蛋白质疏水性；利用ProtParam分析蛋白的理化性质；使用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de）预测蛋白结构域；利用SWISS-MODEL（https://SWISSMODEL.expasy.org）预测 ZmMETS1/ZmMETS2/ ZmMETS3的三维结构；用MEGA7.0软件中的最大似然法（Maximum likelyhood method）构建进化树。

1.2.3 ZmMETS的转录水平表达分析 使用全式金试剂盒TransStart Top Green qPCR SuperMix，根据说明书进行体系的配制。实时荧光定量PCR程序为94℃ 30 s；94℃ 5 s，58℃ 30 s，40个循环；根据赛默飞世尔科技QuantStudio1仪器设定溶解曲线程序。通过2-ΔΔCt法计算相对表达量。每个样品设置3个平行重复。以玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）编码基因ZmGAPDH作为内参。

2 结果

2.1 ZmMETS的蛋白信息分析

提取B73叶片的总RNA，并反转录获得cDNA，运用RT-PCR方法分别获得包括开放阅读框的3个片段，长度分别为2 352、2 822和2 758 bp。挑取阳性克隆测序后得到ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3开放阅读框的核苷酸序列。经过分析，ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3核苷酸编码序列长度分别为2 301、2 298和 2 298 bp。

通过软件预测明确3个蛋白的分子量均为84.5 kD，均为亲水性蛋白质（图1-A-C）。ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3的等电点分别为5.54、5.83和5.85。这3个蛋白都含有2个非依赖钴胺素合酶结构域（图1-D-F），分别位于N端和C端。

图1 ZmMETS的亲疏水性和结构域预测Fig.1 Prediction of hydrophilicity，hydrophobicity，and protein domain of ZmMETS

3个ZmMETS蛋白结构高度相似，都含有分别负责结合和催化的2个结构域。利用Swiss-model在线网站对ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3蛋白的三维结构进行预测，结果显示3个蛋白得到的预测模型一样，含有2个结构域，合酶1结构域位于N端，执行结合功能，合酶2结构域位于C端，执行催化功能，每个结构域由α螺旋环绕平行的β片层构成的立体结构，甲硫氨酸位于C端结构域（图2）。将代表性物种中的METS同源基因构建的系统进化树显示，玉米中的METS和高粱的同源蛋白亲缘关系最近（图3）。

图2 ZmMETS的三维结构预测，甲硫氨酸位于C端结构域Fig.2 Three-dimensional structure prediction of ZmMETS，and methionine locates in C-terminal domain

图3 METS同源基因的进化分析Fig.3 Evolutionary analysis of METS homologous proteins

2.2 ZmMETS的组织表达模式分析

通过提取散粉时期玉米的根、茎、叶、雄穗、雌穗以及授粉后25 d的胚、胚乳、籽粒的RNA，运用实时荧光定量PCR技术研究ZmMETS同源基因的表达模式。结果表明，这3个同源基因在玉米的各个组织中均有表达，其中，ZmMETS1的表达水平远远高于ZmMETS2和ZmMETS3（图4-A）。以根中表达为对照，ZmMETS1在茎和雌穗中表达量较高，在叶片中表达量较低（图4-B）；ZmMETS2在茎、雌穗和胚乳中的表达量差异不明显，而在叶、胚和籽粒中表达很低（图4-C）；ZmMETS3在雌穗中表达量较高，在胚和籽粒中较低（图4-D）。因此，推测ZmMETS1在植株的各个部位起主要作用。

图4 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3在不同组织中的相对表达量Fig.4 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 in different tissues

2.3 萌发过程中ZmMETS的表达模式分析

将玉米B73自交系的种子在清水中浸泡36 h，下胚轴突破种皮，72 h时下胚轴长约1 cm。从浸种开始，ZmMETS1的表达量远高于ZmMETS2和ZmMETS3（图5-A）。ZmMETS1在12 h后表达量急剧增高，36 h达到高峰，然后下降为最高峰的1/2（图5-B）；ZmMETS2在36 h内表达量没有明显变化，然后下降为初始的1/10（图5-C）；ZmMETS3的变化模式与ZmMETS1类似，12 h后急剧增高，36 h达到高峰，48 h表达量急剧下降，仅为最高峰的1/4，60 h又增高，达到24 h的水平，然后再缓慢下降（图5-D）。这说明不同的同源基因在萌发中的转录模式不同。

图5 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS13在萌发过程中的相对表达量Fig.5 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 during germination

3 讨论

植物中甲硫氨酸合酶不仅催化从头合成中的最后一个反应，而且还用于甲基的重复再利用，其蛋白结构是比较保守的［20，26］。前人开展的研究主要都集中在拟南芥和拟南芥基因在作物中的外源表达，而作物自身编码基因的功能鲜见报道［10，25，27］。本试验从B73的叶片组织中分别克隆得到了ZmMETS的3个同源基因，Swiss-model三维结构预测显示它们编码的蛋白N段具有典型的非依赖钴胺素合酶结合结构域，C段具有典型的非依赖钴胺素合酶催化结构域，属于甲硫氨酸合酶家族基因［26］，还需要进一步的酶学试验证实。

ZmMETS同源基因的组织表达模式的共性在于它们在雌穗中的表达水平较高，在其他部位则表达模式各自不同。ZmMETS1在各组织中的表达量均最高，只是在叶片中表达水平低一些，约为根中表达量的一半；ZmMETS2在叶片、胚和籽粒中的表达水平都只有根的15%；ZmMETS3在雌穗中的表达水平最高，在胚和籽粒中表达水平最弱。这个现象与在拟南芥中的观察类似，拟南芥中AtMETS1转录水平总体很高，在花中的转录水平最高；不同的地方在于拟南芥3个同源基因的根部的转录水平相对其他部位来说很低；AtMETS2主要在茎中转录水平高，而AtMETS3主要在种子中转录［20］。这说明不同物种中甲硫氨酸合酶具体执行的功能可能根据不同组织的甲基代谢与一碳代谢的需求而不同，其具体生物功能有待进一步深入研究。

种子萌发过程中，一碳代谢与甲硫氨酸代谢都在发生剧烈的变化。豌豆萌发2 d时，叶酸含量是种子的2倍以上，HPPK/DHPS的mRNA丰度是初始的5倍［28］。玉米中主要变化的是5甲基四氢叶酸，2 d时5甲基四氢叶酸的含量相对是初始的1 000多倍，特别是4尾形式的叶酸占比显著增加［29］。拟南芥中，萌发1 d时，甲硫氨酸的含量接近初始的2倍，AtMETS1是初始的25倍以上，然后缓慢下降，到48 h时为初始的5倍左右；AtMETS2和AtMETS3几乎没有变化，48 h时增加为初始的5倍左右［24］。玉米中ZmMETS同源基因在萌发过程中的表达模式不同于拟南芥中的观察。尽管ZmMETS1是转录水平最高的基因，它和ZmMETS3随时间的转录模式很类似，都是在萌发后转录水平急剧增加，36 h时达到高峰，然后下降；ZmMETS2转录水平在48 h显著低于初始。这说明这3个同源基因可能参与的生物学过程有所不同，其调控机制差异需要进一步详细分析。

4 结论

玉米中存在3个具有组成型表达特征的玉米甲硫氨酸合酶基因，ZmMETS1可能在雌穗发育和萌发过程中起主要作用。